聚多巴胺納米纖維膜固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜檢測淡水魚中四環素類和氟喹諾酮類藥物殘留

梁思慧, 戴海蓉, 張鏵尹, 李 建, 張秋萍, 許 茜,3*, 王春民*

(1. 東南大學公共衛生學院營養與食品衛生學系, 江蘇 南京 210009; 2. 蘇州市疾病預防控制中心, 江蘇 蘇州 215100; 3. 東南大學環境與醫學工程教育部重點實驗室, 江蘇 南京 210009)

水產品是優質蛋白質、多種不飽和脂肪酸等多種營養物質的主要食物來源,為滿足人們的食用需求,多采用集約化養殖,這種高密度養殖也給防疫帶來了壓力[1,2]。四環素類和氟喹諾酮類藥物是常用的抗菌類藥物,在水產品中的殘留檢出率也較高,對消費者的健康有潛在風險[3]。因此,許多國家和組織,包括美國、中國、日本、歐盟(EU)等均建立了水產品等動物源性食品中藥物的最大殘留限量(MRL)[4-8],作為食品安全監測工作的依據。

超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)是動物源性食品中藥物殘留檢測的主要方法,但由于藥物殘留水平較低(μg/mL或μg/L),且實際樣品中脂肪、蛋白質等常嚴重抑制質譜的電離效率,進而影響分析結果的準確度和靈敏度[9,10],因此,UPLC-MS/MS檢測前必須進行樣品預處理,以去除雜質、富集目標物。在我國檢測水產品中獸藥殘留的國家標準、行業標準[11-13]和相關的研究報道[14-16]中,固相萃取(SPE)是最常采用的樣品前處理方法。SPE技術主要基于萃取介質對目標物的吸附作用,因此新型吸附介質的開發應用成為其重要的發展方向之一[17-20]。納米纖維(nanofibers, NFs)是最典型的納米材料之一,靜電紡絲法(electrospinning,簡稱電紡)作為制備NFs的通用方法,為制得納米纖維膜(NFsM)提供了技術支持[21]。根據目標物性質和檢測樣品的特點,NFsM可被功能化修飾,獲得的功能化NFsM是一種新型高效的SPE介質[22]。筆者課題組自2008年起即開展了基于功能化NFsM的SPE工作[23-30],研制了多種吸附和解吸附效率雙高的功能化NFsM,并在食品安全分析、環境監測、生物樣本分析等方面實現了良好應用。

聚多巴胺(PDA)的結構中含有兒茶酚和胺類官能團,是由鹽酸多巴胺在弱堿性溶液(pH>7.5)中通過氧化自聚合而合成的[31]。PDA具有良好的親水性和生物相容性,可與目標分析物形成各種相互作用,如π-π堆積、靜電作用、疏水作用和氫鍵等[32]。因此,PDA被認為是的一種新型吸附介質[33,34],已應用于SPE[35]、固相微萃取(SPME)[36]等樣品前處理方法。PDA修飾后的NFsM是一種“強強聯合”的高效SPE介質,其兼具豐富的吸附機制、快速的傳質效能和高效的基質凈化能力。多項研究提示[36-38], PDA功能化修飾的納米纖維有望成為一種優越的SPE吸附介質,但將其應用于動物源性食品中藥物殘留檢測的研究還未見報道。

本文研制PDA功能化的聚苯乙烯(PS)納米纖維膜(PDA-PS NFsM),建立了基于PDA-PS NFsM的新型SPE方法,聯合UPLC-MS/MS,檢測在水產品中檢出率較高的3種四環素(四環素、土霉素、金霉素)和3種氟喹諾酮(恩諾沙星、環丙沙星、諾氟沙星),對方法的準確度和精密度等效能進行了評價,并通過對實際淡水魚樣品中6種目標物的檢測,驗證了方法的實際應用性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UPLC超高效液相色譜儀、Xevo TQD三重四極桿質譜儀(配TQD質量檢測器、Acquity自動采樣器、ESI源,美國Waters公司), Quanta 200 FEG場發射掃描電子顯微鏡(捷克FEI公司), TENSOR27傅里葉變換紅外光譜儀(日本Shimadzu公司), 24孔固相萃取裝置(美國Supelco公司), Heraeus Multifuge X1R型臺式離心機(美國Thermo公司)。

聚苯乙烯(Mr260 000)、鹽酸多巴胺(純度為98%)和Tris緩沖溶液購于上海阿拉丁有限公司。乙腈和甲醇均為HPLC級,購自德國Merck公司。配制EDTA-McIlvaine’s緩沖液所用試劑十二水合磷酸氫二鈉、一水合檸檬酸、乙二胺四乙酸,以及十二烷基苯磺酸鈉、四氫呋喃和N,N-二甲基甲酰胺均購自上海國藥化工公司。標準物質:四環素(TET)、金霉素(CTC)、土霉素(OTC)、恩諾沙星(ENR)、環丙沙星(CIP)、諾氟沙星(NOR),純度均為98.0%,均購自美國Sigma公司。

準確稱取10.0 mg各標準物質,分別溶解于10.0 mL甲醇,配制成質量濃度為1 000 mg/L的標準儲備溶液。分別取一定體積的儲備溶液,混合,用甲醇稀釋得各目標物質量濃度均為10 mg/L的混合標準溶液。用超純水稀釋混合標準溶液,得到所需濃度的標準工作溶液。所有的溶液均保存于4 ℃備用。

1.2 PDA-PS NFsM材料的制備

稱取0.3 g十二烷基苯磺酸鈉,溶于10 mL四氫呋喃中,再加入20 mLN,N-二甲基甲酰胺,混合均勻后,稱取6 g聚苯乙烯粉末溶于上述溶液中,在磁力攪拌器上攪拌至均一溶液。用靜電紡絲法制備納米纖維膜,電壓為19 kV,流速為1.0 mL/h,紡制時間為0.5 h,即可制得直徑約為(12±1) cm、厚度約為(100±10) μm近似圓形的PS NFsM材料。將鋁箔紙接收板在室溫干燥2 h后揭下,作為基底膜進行聚多巴胺修飾。

稱取2 g鹽酸多巴胺,溶于200 mL Tris緩沖液(10 mmol/L, pH 8.5)中,將PS NFsM平鋪于大玻璃平皿中,用上述配制完成的鹽酸多巴胺溶液將其完全浸潤,保鮮膜密封后,于60 ℃避光水浴反應12 h后,用超純水清洗至浸出液澄清,烘干,得到厚度約為190 μm的PDA-PS NFsM材料。

表 1 6種目標物的質譜參數

將如上制得的PDA-PS NFsM材料用打孔器裁剪,得到質量為(20.0±0.1) mg、直徑為1 cm的PDA-PS NFsM圓片,然后夾在兩個篩板之間,放入內徑為1 cm的潔凈空柱管底部,即得自制SPE小柱,如圖1所示。此SPE柱依次用0.5 mL去離子水、0.5 mL甲酸-乙酸乙酯(含20%甲醇)(1∶99, v/v)和0.5 mL去離子水活化后備用。

圖 1 自制SPE小柱示意圖Fig. 1 Diagram of handmade SPE cartridgePDA-PS NFsM: polydopamine-polystyrene nanofiber mat.

1.3 樣品前處理

在蘇州市姑蘇區農貿市場采集淡水魚樣品共16份。每份淡水魚樣品分別取其身體兩面的背部、腹部、尾部魚肉各約5 g,混合后絞碎成肉糜,置于50 mL離心管中,密塞并準確標記樣品號,于-20 ℃保存,一周內完成檢測。

稱取(2.00±0.05) g室溫下解凍后的魚肉糜,置于15 mL具塞離心管中,加入2.00 mL提取液(乙腈-EDTA-McIlvaine’s緩沖液(1∶1, v/v)),以2 000 r/min渦旋混合5 min,于4 ℃以11 000 r/min離心5 min。取1 mL上清液,用超純水稀釋至10 mL,得到樣品溶液。將10 mL樣品溶液以3 mL/min的速率通過1.2節所述的SPE小柱,用1 mL甲酸-乙酸乙酯(含20%甲醇)(1∶99, v/v)直接洗脫,洗脫液氮吹至干,用0.1 mL 10%甲醇水溶液(含0.2%甲酸)復溶后,進行UPLC-MS/MS檢測。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Acquity UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫:40 ℃;流動相:A為甲醇,B為0.1%甲酸溶液;流速:0.2 mL/min。線性洗脫程序:0～3.0 min, 95%A; 3.0～4.8 min, 95%A～5%A; 4.8～5.0 min, 5%A～95%A; 5.0～5.5 min, 95%A。進樣量:5 μL。

1.4.2質譜參數

離子源:ESI源;掃描模式:正離子掃描模式;監測方式:多反應監測(MRM)模式;毛細管電壓:3.0 kV,脫溶劑溫度:350 ℃,脫溶劑氣流速:800 L/h。各目標物的具體質譜參數見表1。

圖 2 PS NFsM和PDA-PS NFsM的傅里葉紅外光譜圖Fig. 2 FT-IR spectra of PS NFsM and PDA-PS NFsM

圖 3 (a)PS NFsM和(b)PDA-PS NFsM的場發射掃描電鏡圖Fig. 3 Field emission-SEM images of (a) PS NFsM and (b) PDA-PS NFsM

2 結果與討論

2.1 PDA-PS NFsM材料的表征

對制得的PS NFsM和PDA-PS NFsM材料進行了傅里葉紅外光譜和場發射掃描電鏡表征。如圖2所示,在1 287、1 488、1 615和3 200 cm-1處出現了強的吸收峰,分別對應氨基上N-H的振動吸收峰、芳香環的特征峰、C=C的特征峰和鄰苯二酚上-OH的吸收峰,說明PDA-PS NFsM材料制備成功。PS NFsM表面光滑,平均直徑為700～900 nm(見圖3a)。PDA包覆于PS NFsM形成了核-殼形貌的PDA-PS NFsM(見圖3b),其表面較PS NFsM明顯粗糙,纖維直徑增大,內部呈蜂窩狀多孔結構。

2.2 SPE影響因素的考察及條件優化

PDA-PS NFsM材料的用量、離子強度、樣品溶液的流速和洗脫液等,都會對萃取效率產生影響。以所有目標物均未檢出的淡水魚樣品作為空白樣品,按1.3節進行預處理,得到空白樣品溶液,在其中加入一定體積的混合標準溶液,以回收率為指標,采用樣品基質匹配的加標溶液進行SPE影響因素的考察及條件優化。

2.2.1吸附劑的使用量

考察自制SPE小柱中PDA-PS NFsM材料的質量對6種目標化合物萃取效率的影響。在對基底膜進行PDA修飾時,改變60 ℃避光水浴的反應時間(3、6、9、12和15 h),即可得到厚度約為130、150、170、190、210 μm的PDA-PS NFsM材料,然后使用內徑為1 cm的打孔器獲得質量分別為(5.0±0.1)、(15.0±0.1)、(20.0±0.1)和(25.0±0.1) mg的PDA-PS NFsM圓片。從圖4a可以看出,采用5～20 mg PDA-PS NFsM材料時,回收率呈上升趨勢,采用20～25 mg時,回收率趨于平穩,說明20 mg 的PDA-PS NFsM材料足夠用于吸附目標分析物。

圖 4 (a)吸附劑的使用量、(b)離子強度、(c)樣品溶液的流速和(d)洗脫液對6種目標化合物萃取效率的影響(n=4)Fig. 4 Effects of (a) mass of adsorbent, (b) ionic strength, (c) flow rates, and (d) eluents on the extraction efficiencies of the six target compounds (n=4)

2.2.2離子強度

用含有0～1.5 g NaCl的樣品溶液考察離子強度對SPE萃取效率的影響。在10 mL的樣品溶液中分別加入0、0.5、1.0、1.5 g NaCl,然后進行固相萃取,檢測洗脫液中6種目標物的含量。從圖4b可以看出,當NaCl的添加量由0 g增加至0.5 g時,6種目標物的回收率均下降;當NaCl的添加量為0.5～1.0 g時,TET和OTC的回收率仍下降,而其他4種目標物的回收率小幅回升,這可能是由于各目標物對離子強度的敏感性不同;當NaCl的添加量為1.0～1.5 g時,6種目標物的回收率均小幅上升,但仍低于NaCl添加量為0 g時。因此不需要在樣品溶液中添加NaCl。

2.2.3樣品溶液的流速

在保證回收率的前提下,提高流速可以縮短前處理的時間。樣品溶液分別以1～7 mL/min的流速通過裝填有20 mg PDA-PS NFsM材料的SPE小柱,考察流速對6種目標物回收率的影響。如圖4c所示,當流速從1 mL/min增加至3 mL/min時,6種目標物的回收率雖有所下降,但基本處于90%以上;當流速大于3 mL/min時,6種目標物的回收率均大幅度下降。當流速從1 mL/min增加至3 mL/min,上樣時間可從10 min縮短至3.3 min。因此經過綜合考慮,選擇3 mL/min作為樣品溶液的流速。

2.2.4洗脫液組成

選擇洗脫液的標準是能夠盡可能多地將吸附于PDA-PS NFsM材料的目標分析物解吸。研究了弱極性溶劑乙酸乙酯,強極性溶劑甲醇、甲醇-乙酸乙酯(8∶2, v/v)和甲酸-乙酸乙酯(含20%甲醇)(1∶99, v/v)對6種目標物的洗脫能力。結果表明,氟喹諾酮類藥物對pH值敏感,在酸性條件下的加標回收率顯著提高。綜合考慮后,當使用甲酸-乙酸乙酯(含20%甲醇)(1∶99, v/v)時,6種目標物的回收率最好(見圖4d)。

2.3 突破體積的考察

在固相萃取時,隨樣品溶液的加入,吸附介質對目標物吸附逐漸達到飽和,當目標物不再被吸附時所能流過的最大樣品溶液體積即為穿透體積。當樣品溶液體積超過突破體積時,萃取效率會顯著降低。因此,本文對突破體積進行了考察,結果如圖5所示，當樣品溶液體積為10～50 mL時,各目標物回收率均>93%,當樣品溶液體積增大至60～70 mL時,回收率有明顯的下降。因此樣品的突破體積約為50 mL。本文采用10 mL的樣品溶液,并未超過突破體積,不會影響萃取效率。

圖 5 突破體積對6種目標化合物萃取效率的影響(n=6)Fig. 5 Effect of breakthrough volumes on the extraction efficiencies of the six target compounds (n=6)

2.4 方法學驗證

2.4.1線性范圍、檢出限和定量限

各目標物的LOD和LOQ分別以3倍和10倍信噪比(S/N)時的加標水平計。結果表明,6種目標分析物的LOD和LOQ分別為0.3～1.5 μg/kg和1.0～5.0 μg/kg, LOD低于國家標準[12,13](氟喹諾酮類LOD: 20 μg/kg,四環素類LOD: 50 μg/kg)和行業標準[11](四環素類LOD: 50～100 μg/kg),提示本文方法檢測靈敏度更優。

空白樣品按1.3節進行前處理,得到空白樣品溶液,加入不同體積的混合標準溶液,得到系列濃度的基質匹配工作溶液,按1.4節進行UPLC-MS/MS分析。以測得的目標物峰面積為縱坐標、對應的加標水平為橫坐標,分別繪制標準曲線。各目標物標準曲線的線性范圍為其各自的LOQ～1 000 μg/kg(約為所有目標物MRL的1.5～10倍),線性關系良好,決定系數(R2)均大于0.999(見表2)。

表 2 6種目標物的線性范圍、線性方程、R2、LOD和LOQ

2.4.2準確度和精密度

為了評估方法的準確度和精密度,在空白樣品中加入不同體積的混合標準溶液,分別得到低、中、高(LOQ、200和1 000 μg/kg)3個加標水平的模擬樣品,每個加標水平制備6個平行樣(n=6)。各加標模擬樣品按1.3節和1.4節進行前處理和分析。同時以1 d內和連續4 d低、中、高3個加標水平下各目標物含量的相對標準偏差(RSD)計日內和日間精密度。結果如表3所示,各目標物的相對回收率為94.37～102.82%,日內及日間RSD均小于10%。本文方法準確度結果與國家標準[12,13]和行業標準[11]相比更優,精密度結果相當。

2.4.3基質效應

為了評價PDA-PS NFsM材料對魚肉基質的凈化能力,比較了固相萃取前后加標淡水魚樣品中各目標物的提取離子流色譜圖(見圖6)。可見,在未經PDA-PS NFs SPE小柱凈化濃縮前,色譜圖中可見雜質峰存在,且響應值較低;經過固相萃取后,雜質峰明顯降低,目標物響應值明顯升高,顯示了PDA-PS NFsM材料良好的基質凈化能力和目標物富集能力。

圖 6 6種目標物的提取離子流色譜圖Fig. 6 Extract ion current chromatograms of the six target compounds a. spiked fish sample without SPE (50 μg/kg); b. spiked fish sample after SPE (50 μg/kg); c. standard solution (50 μg/L).

表 3 淡水魚中6種目標物的回收率和RSD

基質效應=(基質匹配工作溶液中各目標物的峰面積-標準工作溶液中各目標物的峰面積)/標準工作溶液中各目標物的峰面積。空白樣品經提取和固相萃取,可得加標(200 μg/L)基質匹配工作溶液,將其與同濃度的標準工作溶液分別行UPLC-MS/MS分析,計算固相萃取后的基質效應。同理對空白樣品進行提取,但不固相萃取,可計算得到固相萃取前的基質效應。

結果表明,固相萃取前的基質效應為-12.98%～-38.68%,而在基于PDA-PS NFsM的固相萃取后,每個目標分析物的基質效應顯著降低至-2.15%～-7.36%,表明基于PDA-PS NFsM的固相萃取有效凈化了樣品基質。

2.5 與其他方法比較

將本方法與文獻[39-42]方法進行了比較(文獻檢索策略:關鍵詞為水產品、四環素類或氟喹諾酮類藥物殘留、固相萃取和質譜檢測;檢索年份為2010～2020;檢索數據庫為知網、Web of Science)。結果如表4所示,基于PDA-PS NFsM材料的優越性能,本文吸附劑PDA-PS NFsM用量只及文獻方法的4%～40%。各目標物的工作曲線線性范圍更寬,LOD相當,回收率更高而RSD較低,表明本文方法具有良好的靈敏度、準確度和精密度,具有較好的實際應用潛力。

表 4 本方法與其他方法的比較

2.6 實際樣品檢測

16份淡水魚樣品按1.3節和1.4節進行前處理和分析,每份樣品做3個平行。結果表明,3份樣品中檢出了藥物殘留,其中1份樣品檢測到ENR和CIP,殘留量分別為60.22 μg/kg和31.90 μg/kg,另2份樣品中檢出了TET,殘留量分別為19.41 μg/kg和26.32 μg/kg。采用國家標準[12,13]對16份樣品進行了檢測,得到的檢出情況及測得水平與上述結果一致,表明了本文方法實際應用可行。

3 結論

本文將PDA與NFsM的優勢相結合,研制了PDA-PS NFsM材料作為SPE介質,PDA-PS NFsM材料不僅可同時提取四環素類和氟喹諾酮類藥物殘留,且對復雜的樣品基質具有良好的凈化能力。建立了基于PDA-PS NFsM材料的SPE技術,結合UPLC-MS/MS,研發了同時測定淡水魚中四環素、金霉素、土霉素、恩諾沙星、環丙沙星、諾氟沙星的檢測新方法。方法學考察的結果表明,本文方法靈敏度、準確度和精密度與國家標準、行業標準或文獻方法相當或更優,能滿足實際樣品檢測的要求。