基于L-谷氨酸的手性硅膠球的制備及其應用

熊婉淇, 彭 博, 段愛紅, 袁黎明

(云南師范大學化學化工學院, 云南 昆明 650500)

手性是一種在生命系統中廣泛存在的特征,是自然界的基本屬性。在各個領域有著諸多應用。例如在藥物方面,用于臨床的1 700～2 000種合成藥中,約有40%為外消旋體[1]。手性藥物的左旋體和右旋體雖然具有相同的理化性質,但是它們的藥理作用存在一定差異,甚至有相反的藥理作用[2]。例如,苯并嗎啡烷的兩個對映體都有鎮痛作用,但(+)-苯并嗎啡烷服用后會成癮,而(+)-苯并嗎啡烷則不會。所以對手性化合物進行拆分是非常有必要的。

HPLC是目前使用范圍廣、拆分效率高的手性拆分方法之一[3]。HPLC在進行手性拆分的過程中起到核心作用的是色譜柱,其手性拆分能力取決于手性色譜填料,也稱之為手性固定相(CSP)[4]。HPLC柱填料中主要的固定相材料是無機填料,主要包括硅膠、碳機制填料、氧化鋁、氧化鋯等[5,6],其中硅膠占九成以上[7]。因此,研究手性硅膠就顯得尤為重要。手性硅膠分為兩大類,一類是無機手性硅膠[8],另一類是在表面鍵合[9]或者涂覆[10]手性物質的硅膠,目前以后者占多數。但是這類固定相不耐高溫,色譜柱壽命較短,受流動相種類限制大。無機手性硅膠在這些方面的限制小,因此無機手性介孔硅成為研究的前沿。經過長期的理論和實踐總結,Unger等[11]給出了HPLC理想固定相的評價標準:無定型微粒填料不利于傳質,會使操作壓力增大,所以色譜柱填料最好為球形且粒徑分布均勻的微粒。尤其是直徑為2～5 μm球形微粒的優勢更加明顯,會比無定型微粒色譜柱的柱效更高。

各研究人員[12-14]分別合成了左手螺旋結構的手性向列相液晶薄膜、螺旋形貌和螺旋孔道介孔硅,以及用十二烷基硫酸鈉為結構導向的螺旋介孔材料。袁黎明課題組[15-17]以這些為基礎合成了片狀手性向列相介孔硅,六方棱柱螺旋手性介孔硅以及短棒狀手性無機介孔硅,但是這些報道全是無定型材料,并未見球形的全無機手性硅膠用作液相色譜手性固定相的研究中。

本文以無機球形介孔硅膠作為研究對象,將其用作高效液相色譜固定相,目的是制成一類制作簡單便捷、可耐高溫、可適應多種流動相并且有良好手性分離性能的新型手性固定相。主要研究工作是采用堆砌硅珠法[18-21],用L-谷氨酸(L-Glu)為手性源,以硅溶膠為硅源合成脲醛樹脂和二氧化硅混合小球,經高溫煅燒除去有機部分獲得無機手性硅膠球,手性來源于硅膠球自身的孔結構和骨架。然后將手性硅膠球填充到HPLC柱中,并在一定條件下,讓L-Glu手性硅膠球固定相對手性外消旋異構體和常見的苯系位置異構體進行拆分,最終對15對外消旋體和10種苯系位置異構體有不同的拆分效果。

1 實驗部分

1.1 儀器及材料

Elite P230Ⅱ高效液相色譜儀配有AT-330柱溫箱(大連依利特公司); S-3000N掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司); JEM-2100透射電子顯微鏡(日本JEOL公司); Chirascan圓二色譜儀(英國Applied Photophysics公司); SX2-4-10馬弗爐(上海意豐電爐有限公司); DJ-1大功率磁力攪拌儀(常州申光儀器有限公司); TDZ5-WS臺式低速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司);不銹鋼液相色譜空柱(250 mm×2.0 mm)和1666型液相色譜裝柱機(美國Alltech有限公司); DHG-9035A鼓風電熱干燥箱(上海恒以科學儀器有限公司); ASAP2020 M+C氮氣吸附儀(美國Micromeritics公司)。

L-谷氨酸(純度>99%)、尿素(純度≥99%)購于大連美倫生物公司;甲醛水溶液(純度37%～40%)購于上海Adamas試劑公司;硝酸(純度65%～68%)購于重慶川東化工有限公司;粗制硅膠購于中國青島美高化工有限公司;硅溶膠純度為30%，以及手性化合物:特羅格爾堿、吡喹酮、氨氯地平、3-芐氧基-1,2-丙二醇、芐氟噻嗪、1-苯丙醇、4-甲基-2-戊醇、2-氯丙酸、1,2-環氧己烷、氧化苯乙烯、3-羥基-2-丁酮、2-甲基環己酮、2-氯環己酮、2-甲基四氫呋喃-3-酮、異丙基縮水甘油醚純度均>98%,均購于美國Sigma-Aldrich公司;位置異構體:o,m,p-氨基苯酚、o,p-氯苯酚、o,m,p-碘苯胺、o,m,p-甲苯胺、o,m,p-二硝基苯、o,m,p-氯苯胺、o,m,p-硝基苯胺、o,m,p-硝基苯酚、o,m,p-溴苯胺、o,p-硝基溴苯、o,m,p-苯二胺純度均>97%,購于上海阿拉丁化學試劑公司。

1.2 以L-Glu為手性源的手性硅膠球材料的制備

取1 mmol L-Glu溶于20 mL硅溶膠中,加入1.0 g尿素,攪拌20 min。用1 mol/L HNO3將溶液pH值調至1.5,攪拌加入1.5 mL 37%甲醛水溶液,反應15 min,然后加入200 mL去離子水使反應停止,分別用水、甲醇、丙酮洗滌3次,于60 ℃干燥12 h。最后將其置于馬弗爐,在550 ℃下高溫煅燒6 h后降到室溫,得到L-Glu手性硅膠球，制備過程見圖1。

1.3 L-Glu手性硅膠球液相色譜柱的填充

取1.2 g干燥后的L-Glu手性硅膠球分散到23 mL正己烷-異丙醇(9∶1, v/v)溶液中。采用高壓勻漿法裝柱,制備色譜柱(250 mm×2.0 mm)。

1.4 色譜條件

流動相為正己烷-異丙醇(9∶1, v/v),流速為0.1 mL/min,紫外檢測波長為254 nm,柱溫為25 ℃。

2 結果與討論

2.1 L-Glu手性硅膠球的形成原理

采用堆砌硅珠法,得到含有大量L-Glu的二氧化硅脲醛樹脂球,經過洗滌、煅燒、浮選后得到L-Glu手性硅膠球。具體反應如下:

該反應由于L-Glu的加入,L-Glu中的-NH2基團會部分取代尿素中的-NH2基團參加反應,使縮聚產生的多聚體帶有含手性碳原子的L-Glu。在多聚體相對分子質量不斷增長的過程中,其會使硅溶膠中的二氧化硅納米粒子逐漸團聚而最終沉降。而L-Glu具有一定的印跡以及誘導作用,在二氧化硅納米粒子團聚時,所生成的產物具有一定的手性。

2.2 L-Glu手性硅膠球的表征

2.2.1L-Glu手性硅膠球的元素分析

對L-Glu手性硅膠球進行元素分析,結果見表1。結果顯示,L-Glu手性硅膠球中幾乎不含C元素和N元素,和商業用粗制硅膠對比發現,N元素含量一致,L-Glu的H元素和C元素含量略多,但總體水平一致,說明L-Glu手性硅膠球被充分煅燒,合成中使用的氨基酸和生成的脲醛聚合物已經被灼燒完全,幾乎不含有機部分,表明L-Glu手性硅膠球是由無機元素構成的材料。

圖 1 L-Glu、尿素和甲醛的縮聚反應Fig. 1 Polycondensation of L-Glu, urea and formaldehyde

表 1 L-Glu手性硅膠球的元素分析

2.2.2L-Glu手性硅膠球的紅外光譜分析

分別對甲醛和尿素反應生成的脲醛樹脂球、在硅溶膠中甲醛和尿素生成的脲醛樹脂球、加入手性源L-Glu在硅溶膠中甲醛和尿素生成的L-Glu脲醛樹脂硅膠球,以及最終經過燒制的L-Glu手性硅膠球,4種材料進行紅外光譜分析(見圖2)。

圖 2 4種材料的紅外光譜圖Fig. 2 IR spectra of the four materials

甲醛和氨基在水溶液中反應生成脲醛樹脂球,可以看出在2 900、1 637和1 246 cm-1處分別為C-H、C=O、C-N的特征吸收峰。反應環境換成硅溶膠后,出現明顯的非晶體的硅吸收峰,包括471 cm-1處的Si-O-Si彎曲伸縮振動吸收峰,793 cm-1處的對稱伸縮振動吸收峰和1 107 cm-1處的反對稱伸縮振動吸收峰。加了手性源的L-Glu脲醛樹脂硅膠球因為紅外顯色基團,與脲醛樹脂硅膠球沒有明顯的不同。經過燒灼的最終產物L-Glu手性硅膠球的紅外光譜,保留了硅的特征峰,并且2 900 cm-1左右峰消失,3 500 cm-1左右的OH吸收峰凸顯。

圖 3 L-Glu手性硅膠球的掃描電鏡和透射電鏡圖Fig. 3 SEM and TEM images of the L-Glu chiral silica spheres

2.2.3L-Glu手性硅膠球的掃描電鏡分析

為進一步了解L-Glu手性硅膠球的形貌特征,對L-Glu手性硅膠球進行掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)分析。從圖3中可以看出,L-Glu手性硅膠球的SEM圖呈現出較為規整無團簇的球形外觀特征,粒徑為3.0～4.5 μm,粒徑分布較為均勻。硅膠球表面呈現出不光滑的小顆粒狀,符合堆砌硅膠球法合成的硅膠球形貌特征。從TEM圖可以看出,L-Glu手性硅膠球是由一顆一顆納米硅膠球堆積而成,其孔徑較為均一,由于是堆積孔,孔與孔之間的排列有交叉現象。

2.2.4L-Glu手性硅膠球的氮氣吸附測試

對L-Glu手性硅膠球進行氮氣吸附測試,使用標準的BET方程對吸附數據進行分析,氮氣吸附脫附等溫線和L-Glu手性硅膠球孔徑分布曲線見圖4。結果表明，L-Glu手性硅膠球的比表面積為117.844 m2/g,孔體積為0.411 cm3/g;通過等溫線的BHJ分析，其平均孔徑為12.312 nm。表明L-Glu手性硅膠球是一種中孔介孔硅膠,適合于一般有機化合物的分離。

圖 4 (a)氮氣吸附脫附等溫線和(b)L-Glu手性硅膠球孔徑分布曲線Fig. 4 (a) Nitrogen adsorption desorption isotherm and (b) pore distribution curves of L-Glu chiral silica spheres

圖 5 不同進樣量下2-甲基四氫呋喃-3-酮的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of 2-methyltetrahydrofuran-3-one with different dosages

2.3 進樣量對L-Glu手性硅膠球色譜柱分離性能的影響

為了研究進樣量對L-Glu手性硅膠球固定相色譜柱分離性能的影響,在相同的條件下,取5、10、15、20 μL的2-甲基四氫呋喃-3-酮進行分析,以此研究進樣量對對映體分離的影響(見圖5)。

隨著進樣量增加,2-甲基四氫呋喃-3-酮的峰面積也在增加,但是保留時間沒有隨著進樣量不同而改變,選擇性也保持穩定。因此在不同的進樣量下，L-Glu手性硅膠球固定相色譜柱能保持穩定。

圖 6 L-Glu手性硅膠球固定相的重復性Fig. 6 Repeatability of the L-Glu chiral silica gel column

2.4 L-Glu手性硅膠球固定相色譜柱的重復性

為了研究L-Glu手性硅膠球固定相色譜柱的重復性,在相同的條件下,對o,m,p-甲苯胺進行5次進樣,色譜圖見圖6。o,m,p-甲苯胺保留時間和峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為0.89%和3.67%。該色譜柱重復性較好。

2.5 L-Glu手性硅膠球固定相對于手性外消旋體的拆分

為了檢測L-Glu手性硅膠球固定相對于外消旋化合物的手性拆分能力,在一定條件下,用以L-Glu手性硅膠球為固定相的高效色譜柱對15種手性外消旋異構體進行拆分。

表 2 L-Glu手性硅膠球色譜柱對15種外消旋體的拆分結果

L-Glu手性硅膠球固定相分離效能采用保留因子(k)、分離因子(α)和分離度(Rs)來評價,色譜柱死時間用三叔丁基苯測量。分離結果顯示,L-Gul手性硅膠球固定相對15種外消旋體均有分離效果,其中特羅格爾堿、吡喹酮、3-芐氧基-1,2-丙二醇、1,2-環氧己烷、3-羥基-2-丁酮、2-甲基四氫呋喃-3-酮、異丙基縮水甘油醚7種外消旋手性異構體能夠達到基線分離。表2是L-Glu手性硅膠球固定相對15種外消旋物質的拆分數據。

L-Glu手性硅膠球是一種手性介孔硅材料。L-Glu為手性硅膠提供手性環境,使其具有手性孔道和骨架,讓原本沒有分離性質差異的對映體產生分離差異,從而達到分離效果;多孔結構也讓外消旋體與其內壁上的作用位點的接觸面增大,使外消旋體分配系數增大,提高了分離效率。手性固定相和對映體間的氫鍵作用對對映體也起到了拆分作用,如上述外消旋體中氨氯地平有H-N鍵、H-O鍵,3-芐氧基-1,2-丙二醇有H-O鍵等,除此之外偶極相互作用力以及范德華力也對對映體的拆分起到了作用。

2.6 L-Glu手性硅膠球固定相對于苯系位置異構體的拆分

為了檢測L-Glu手性硅膠球固定相對于苯系位置異構體的拆分能力,在一定的條件下,用L-Glu手性硅膠球固定相色譜柱對11種常見的苯系位置異構體進行分離。分離結果表明,除o,m,p-苯二胺外,L-Glu手性硅膠球固定相對其余10種苯系位置異構體均有分離效果,對于o,m,p-氨基苯酚、o,p-氯苯酚、o,m,p-碘苯胺、o,m,p-甲苯胺、o,m,p-二硝基苯、o,m,p-氯苯胺、o,m,p-硝基苯酚、o,m,p-溴苯胺達到基線分離。表3是10種苯系位置異構體的分離數據。

表 3 L-Glu手性硅膠球固定相對于苯系位置異構體的拆分結果

苯系位置異構體鄰位、對位和間位分子的長寬比和體積大小不一樣,所以在固定相上的受力也不一樣,導致其的保留時間不同,從而使位置異構體能夠分離。L-Glu手性硅膠球的多孔結構讓苯系位置異構體與其內壁上的作用位點的接觸面增大,使苯系位置異構體分配系數增大,提高了分離效率。除此之外,某些異構體如氨基苯酚、硝基苯酚等的鄰位異構體形成了分子內氫鍵也對異構體的拆分起到了作用。L-Glu手性硅膠球固定相表現出了在分離苯系位置異構體上的可能性。

3 結論

通過堆砌硅珠法,以L-Glu為手性源,制備了L-Glu手性硅膠球。這種手性硅膠球是一種無機手性硅膠,它彌補了部分其他手性硅膠不耐腐蝕、柱子壽命較短、受流動相種類限制大等缺陷。將L-Glu手性硅膠球用作手性固定相,成功拆分了15種外消旋化合物和10種苯系位置異構體,且對部分外消旋化合物和苯系位置異構體較好的拆分效果。實驗表明,L-Glu手性硅膠球在手性分離方面具有良好的可行性,或是一種低成本、制備便捷的手性無機硅膠固定相。