基于線粒體DNA Cyt b研究城市化對上海金線側褶蛙遺傳結構的影響

張 偉 謝漢賓 楊 剛 王軍馥 李必成 王天厚 王小明，

(1.上海自然博物館，上海，200041；2.復旦大學生命科學學院，上海，200433；3.華東師范大學生命科學學院，上海，200062)

物種進化和多樣性的產生，長期以來都是生物學家研究的熱點。近年來的研究表明，人類活動，包括農業、采礦、伐木和城市化等正在改變生物的進化過程[1-2]。其中城市景觀在全球范圍內的快速擴張，引發最嚴重的生物多樣性喪失[3-4]，城市化已經成為影響物種進化的重要力量。城市化改變了原有棲息地，引起棲息地的減少和破碎化，城市中的道路和基礎設施形成擴散屏障，嚴重影響物種的生存和基因交流[5-7]。現代人類社會正在經歷快速的城市化過程。1950年，全球僅有30%的人口生活在城市中。而到2014年，54%的人口居住在城市中，預計至2050年，全球人口的66%會生活在城市中。近年來，城市化的發展與城市系統中的物種快速進化的關聯，得到了國內外研究者們的廣泛關注。包括Science、Nature、PNAS和Trendsinecology&evolution等知名雜志紛紛報道[2，8-10]。研究發現城市化不僅加速物種(包括動物、植物、真菌及其他生物)表現型的變化速度，同時也改變了城市種群中等位基因頻率，在現代物種進化過程中扮演重要的角色。

全球兩棲動物(Amphibia)面臨嚴重威脅，43%的兩棲動物數量急劇下降，遠遠超過鳥類(Aves)和哺乳類(Mammalia)[11-13]。最近的研究證實，城市化導致的棲息地喪失和破碎化是兩棲動物衰退的最直接原因[14-16]。城市的建設和發展改變了原有的生境，城市公園、社區綠地、綠化帶等殘余的棲息地，被分割在城市中。在這些生境內生物個體被完全或部分的隔離，從而使種內遺傳多樣性減小，種間分化增大[6]，其中擴散能力較弱的兩棲動物遺傳多樣性極大降低，而鳥類和大型的哺乳動物，遺傳多樣性的降低程度不大[17]。

上海市是我國城市化擴張的熱點地區[18]，也是我國城市化率最高的城市。由于城市建設發展及農業用地，這一地區濕地遭到大量破壞，棲息于此的兩棲動物急劇減少。殘余的兩棲動物被道路、建筑隔離和硬質地面分割成不同的小種群，棲息在不同的生態孤島中。金線側褶蛙(Pelophylaxplancyi)在上海市的分布較廣，已有的研究表明城市化影響金線側褶蛙的種群數量和健康指數[19-20]，但是城市化對金線側褶蛙遺傳結構的影響尚不清楚。線粒體基因進化速率快，是研究種內群體分化關系的良好遺傳標記。線粒體Cytb是許多脊椎動物系統發育最常用的分子標記，也包括對金線側褶蛙的研究[21]。此外，近年來對城市環境中兩棲、爬行動物種群遺傳結構的研究也常常使用該標記[22-23]。因此，本研究選擇mtDNACytb作為分子標記，評估上海市城市化對金線側褶蛙的遺傳結構的影響，分析不同城市化區域的金線側褶蛙遺傳多樣性是否存在差異，城市化是否造成各個種群之間的交流障礙。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

本研究在上海市各個地區包括城市公園、郊區和近岸島嶼的10個地點，共采集的金線側褶蛙成體樣本235個，采樣點基本覆蓋了上海市不同城市化程度區域和不同的兩棲類棲息地類型(圖1)。包括城市公園5個：后灘濕地公園(HT)，金海濕地公園(JH)，世紀公園(SJP)，上海植物園(ZWY)，高東公園(GD)；郊區半自然-半農業濕地3個：松江(SJ)，青浦(QP)，南匯(NH)；近岸島嶼的半自然-半農業濕地2個：崇明(CM)，長興(CX)。采樣時從后肢剪去少許組織樣品，放置于95%的乙醇中固定，儲存在-20℃冰箱中待用。

1.2 DNA擴增

用于擴增線粒體DNA細胞色素b基因片段的引物來自文獻[21]，分別為B104：5′-AAC ATC TCT GCA TGA TGA AAC TTC GG-3′和B829：5′-ATT GAG CGA AGG ATG GCG TAG GCGAA-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR的反應總體積為20 μL，包括TaKaRa EmeraldAmp PCR Master Mix 10 μL，引物(10 μmol/L)各0.4 μL，DNA模板2 μL，使用雙蒸水將反應總體積補足20 μL。PCR反應循環設置：95℃預變性5 min，之后94℃變性40 s，55℃退火50 s，72℃延伸1 min，反應35個循環之后，72℃10 min。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工生物工程有限公司雙向測序。

1.3 數據分析

使用Clustal X 2.0進行序列比對[24]，比對后的序列使用DnaSP 5.1篩選單倍型[25]。各個不同種群之間的遺傳分化和基因流，使用Arlequin 3.5軟件計算[26]。使用MEGA 7 軟件，采用最大似然法、鄰接法和最大簡約法進行構建系統發育樹，通過自引導檢驗(bootstrap)獲得系統分支的置信度(重復次數為1 000)。應用PopART 1.7 軟件[27]，基于TCS network分析單倍型之間的發育關系。

2 結果

2.1 遺傳多樣性

從金線側褶蛙的組織樣品中，成功擴增出235個序列，序列長度659 bp，獲得61個單倍型，其中單倍型多樣性(Hd)為(0.856±0.021)，核苷酸多樣性(Pi)為(0.004 3±0.000 3)，平均核苷酸差異為(k)2.948。

2.2 種群間的遺傳分化

從FST值來看，整個上海市各個金線側褶蛙種群之間的遺傳分化程度相對較低，最大值僅為0.296。各個城市公園之間的遺傳分化程度很低，FST值都小于0.1，差異不顯著。郊區種群和市區公園，以及郊區種群之間的遺傳分化程度不高。但是，郊區的3個種群之間的FST值差異顯著，和部分城市公園之間的遺傳分化差異顯著。長興島(CX)、崇明島(CM)和所有種群之間的遺傳分化差異顯著(表1)。

表1 金線側褶蛙10個種群之間的FST值(對角線以下)及相應的基因流水平Nm(對角線以上)

2.3 單倍型系統發生關系和網絡圖

以黑斑側褶蛙(Pelophylaxnigromaculatus)(登錄號：AB980779.1)為外群構建系統發育樹。3種不同的系統發育樹具有基本相同的拓撲結構，最清晰全面的拓撲結構是由最大似然法生成的(圖 1)。系統發育樹發聚為4個較大的分支，分別命名A、B、C。來自島嶼、郊區和城市公園的單倍型，在各個分支上都有分布，表明金線側褶蛙各種群之間的聚類關系復雜。

基于TCS network構建的單倍型的網絡關系圖能夠更加直觀地反映61個單倍型之間的關系。各個種群中的單倍型呈現一種混雜的分布格局。除了來自島嶼的單倍型和城市公園、郊區之間突變距離較遠，其余單倍型之間的突變步數1—3步不等，演化關系呈現多個星狀輻射。

3 討論

3.1 遺傳多樣性

本研究分析了上海市235份金線側褶蛙樣品的mtDNACytb基因的部分序列，和更大的地理尺度范圍內的研究相比，上海市的金線側褶蛙在單倍型(Hd0.856)和核苷酸(Pi0.004)多樣性較低。對比Garcia-Gonzalez等[28]在城市化區域的研究，上海市金線側褶蛙的遺傳多樣性指數與之處于同一水平。

基于線粒體和核基因的研究都表明，城市中心區域的兩棲類和爬行類具有較低的遺傳多樣性，郊區的種群遺傳多樣性較高[28-32]。本研究結果證實了城市環境中的兩棲類種群遺傳多樣性水平較低，郊區多樣性水平較高。此外，南匯(NH)盡管位于郊區，但是多樣性較低，推測可能與該地區為2002年之后采用圍墾促淤的方式成陸有關。

3.2 遺傳差異

上海市的金線側褶蛙種群分化程度處于中低的水平(MaxFST=0.296；MinFST=0.004)。相對較低的FST值，反映了在小地理尺度范圍內，各種群之間有限的遺傳分化。許多研究側褶蛙屬(Pelophylax)系統發生的文獻，主要聚焦在更大地理尺度上的研究[21，33]，相應地也發現了比本研究更高水平的遺傳分化。但是，在一個較小的尺度范圍內，例如上海市，以線粒體細胞色素b作為分子標記，分析側褶蛙的遺傳結構，尚未有人報道。在小尺度范圍內使用COI作為分子標記，研究兩棲類的分化水平，發現Alytesobstetricans(FST=0.029—0.461，20 km距離)分化水平和本研究的相當[28]；而使用微衛星標記的遺傳分化水平較低，如Bufobufo(FST=0.016，5.5—14.5 km 距離)，Ranaluteiventris(FST=0.07，3—34 km距離)和R.sylvatica(FST=0.014，0.05—21 km距離)[34-36]。

河流對于兩棲動物種群分化的影響在不同的研究中并不一致。Marsh等[40]發現溪流促進了低擴散的Plethodoncinereus的遺傳分化，而Zhao等[41]的研究發現河流并不是兩棲動物種群間基因流動的障礙。Zeisset等[42]認為導致這些不同最大可能性取決于河流的特征，如河流的寬度、流量、至上游的距離和洪峰等，以及兩棲動物的特征，如水生和陸生生活模式及擴散能力等。本研究中島嶼種群的研究結果很好地支持了這一推測。崇明(CM)和長興(CX)種群，分別位于長江出海口的位置。這2個島嶼是長江河口沖積形成，其中崇明島是我國第三大島嶼。長江的隔離使得這2個島嶼的種群和上海大陸上的種群之間基因差異顯著，2個島嶼之間的種群之間也分化顯著。

3.3 聚類關系

目前對于大尺度地理范圍的兩棲類系統發育研究表明，各種群之間分歧明顯[21，43-44]。而在較小尺度本研究中的金線側褶蛙的61個單倍型在系統發育上分歧不太明顯，來自城市公園、郊區和島嶼的種群，并沒有規律性的聚合為一個或幾個分支。單倍型的網絡關系圖也更加直觀地體現了這一點。進化樹上3個較大的分支(A、B和C)，聚集的單倍型，也來自不同的地區。盡管各個種群之間的遺傳差異比較明顯，但是不同種群之間的遺傳差異程度并不足以形成不同的單系。

本研究證實了城市化區域金線側褶蛙遺傳多樣性的降低。城市公園、郊區和島嶼的種群之間的遺傳差異同時也驗證了河流在兩棲動物擴散中的作用，較大的河流可能阻礙了兩棲動物的交流，而較小的河流可能有助于兩棲動物的擴散和交流，一定程度上緩解了城市化導致的兩棲類遺傳障礙。