細胞永生化技術研究進展

劉育昆 鄒登朗 祁得勝 劉忠浩 都玉蓉 馬建濱

(青海師范大學生命科學學院，青海省青藏高原生物多樣性形成機制與綜合利用重點實驗室，西寧，810008)

細胞永生化是指體外培養的細胞經過自發的或受外界因素的影響從增殖衰老危機中逃離，從而具有無限增殖能力的過程。而永生化自發發生的概率極低，嚙齒類動物自發性永生化自發發生的概率為10-6—10-5，而人類細胞永生化自發發生的概率則小于10-12[1]。正常情況下在體外條件下培育的細胞可以產生有限次數的增殖以及傳代，但經過有限次數增殖和傳代后，細胞就會停止增殖并發生衰老滅亡，這種情況限制了有關細胞培養實驗的繼續進行，研究者通過基因轉染等技術將外源性永生化基因導入目的細胞中，使永生化基因在靶細胞基因組中整合并表達，建立永生化細胞系。目前研究顯示端粒的長度以及端粒酶的活性與細胞永生化的關聯較密切。研究者對細胞永生化發生機制的研究獲得了較大進展，本文在細胞永生化基本原理的基礎上，對細胞永生化方法進行概述。

1 細胞永生化原理

人的正常細胞在體外培養并分裂一段時間后會進入衰老期(M1期)。除干細胞、生殖細胞外，大部分真核生物細胞都具有該特性。例如人上皮細胞在分裂40至60代后就會停止生長，產生DNA合成蛋白抑制因子，保證DNA復制和染色體分配質量的檢查機制就會發送細胞周期停止信號，阻止DNA合成，細胞不再分裂并開始衰老，而病毒、原癌基因和抑癌基因突變體等則可越過衰老期而進入增長抑制狀態，即危機期(M2期)。細胞在該周期中會逐漸出現退化、死亡的現象；只有罕見的細胞在某些因素的作用下可以激活端粒酶。為了補充或延長端粒，維持端粒長度，這些細胞以自身RNA為模板合成端粒DNA，從而維持染色體的穩定性，使細胞可以順利跳過M2期，從而獲得無限分裂增殖的能力，最終發生細胞永生化[2]。

2 促細胞永生化的幾種方法

2.1 篩選自發突變產生的永生化細胞

這種永生化細胞是在培養期間發生基因突變引起的，這些細胞逾越復制以及衰老的原理尚不清楚，且基因型不穩定，較易丟失有關來源組織的細胞特性。該方法大部分應用于嚙齒類動物細胞的永生化[3]。

2.2 化學致癌物以及射線因素產生細胞永生化

通過電離輻射、X射線、核輻射、60Co等照射處理細胞，使細胞通過射線照射誘導發生永生化。由于放射性元素破壞了細胞穩定性，使染色體重組，抑制抑癌基因的表達，促進與細胞周期延長有關基因的表達，從而維持端粒長度，使細胞老化過程不能正常進行，因此細胞將無限增殖[4]。1997年O’Reilly等[5]通過紫外燈照射2個人類皮膚角質細胞系后發現紫外燈照射能增加這2個細胞系的存活壽命。使用化學致癌物方法使細胞永生化的原理與射線因素產生細胞永生化的原理相同，但是這兩種方法都會使基因組產生部分隨機損傷，所以隨著技術的先進化，這兩種方法已經不再常見。

2.3 病毒感染誘導細胞永生化

將病毒通過轉化感染到正常細胞中，可以改變基因，使部分細胞成功渡過兩個致死期，得到無限增殖的能力，從而誘導細胞永生化[6]。病毒感染誘導細胞永生化是將整個病毒基因組導入細胞，這樣會改變細胞表型，應用于病毒的特定宿主細胞且容易使細胞轉化為腫瘤細胞。例如人乳頭狀瘤病毒、EB病毒、猴腎病毒SV40。

2.3.1 人乳頭狀瘤病毒(HPV)

人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus)是一種對上皮細胞具有高度特異性的DNA腫瘤病毒，該病毒會引起細胞增殖，將正常細胞轉化成乳頭狀瘤細胞。人乳頭狀瘤病毒的永生化率可達10-5[7]。德國科學家Harald zur Hausen 獲得2008年諾貝爾生理學獎，證實了HPV病毒可誘導病發宮頸癌。在HPV編碼基因中，占基因組50%的早期區表達蛋白含有E1—E8 8個閱讀區，其中E6和E7兩個閱讀區編碼相應蛋白，可以改變細胞的末期分化，使細胞逾越保證DNA復制和染色體分配質量的檢查機制，從而使細胞永生化。所以E6和E7兩個閱讀區在細胞永生化中起到了關鍵作用。有實驗表明被HPV感染的上皮細胞內端粒的長度停止縮短并不斷增長，使細胞達到永生化[8]。

2.3.2 EB病毒

EBV是皰疹病毒(Epstein-Barr virus)，EBV在體外能和培養的B淋巴細胞融合，進而感染B淋巴細胞，使基因通過顯性表達改變細胞周期[9]，使其正常細胞形成永生化的淋巴細胞系。研究發現EBV永生化B細胞的過程主要有6種病毒基因表達：EBV核抗原1(EBNA1)、核抗原2(EBNA2)、核抗原3A(EBNA3A)、核抗原3C(EBNA3C)、核抗原LP(EBNA-LP)以及潛伏膜蛋白1(LMP1)[10]。EBNA1在病毒的潛伏期和裂解周期都有表達，在病毒的復制和分離中起著重要作用，EBNA1是一種序列特異性DNA結合蛋白，能幫助病毒基因與細胞有絲分裂染色體結合[11-12]，Mühe等[13]發現EBNA2通過一個結構域傳遞信號以啟動B細胞永生化，然后利用單獨的結構域維持永生化B細胞生長，并且EBNA2能與EBNA-LP相互作用，共同激活[14]。B細胞進行體外轉化時，EBNA3A、EBNA3C、LMP-1起到了至關作用。EBV癌蛋白LMP-1組成型激活NF-κB，促進轉化細胞增殖并抑制凋亡，對EBV永生化B細胞的存活至關重要[15]。

研究發現，被EB病毒感染的淋巴細胞內抑癌基因的轉錄表達水平有所上升，但是細胞壽命并未縮短，這個發現證明了EB病毒可以抑制抑癌基因活性，具有永生化淋巴細胞的能力[16]，EB病毒永生化的B淋巴細胞的最顯著特點是提高端粒酶活性，提高端粒酶活性可能是B淋巴細胞永生化的關鍵原因，當前研究中應用EB病毒感染細胞使細胞永生化最多的是B淋巴細胞，在其他細胞永生化中的應用不多[17]。

2.3.3 猴腎病毒(SV40)

猿猴病毒SV40是由LT和st兩種抗原及相關蛋白組成的簡單的真核細胞病毒，由于猿猴病毒SV40對細胞生長、轉化、瘤化的高效性，現在已應用于真核細胞生物工程實驗[18]。1989年Shay等研究表明，通常情況下，猿猴病毒轉染細胞時發生永生化的概率極低；SV40誘導細胞永生化涉及很多因素，其中LT片段起了決定性作用前對SV40轉染細胞發生永生化的具體機制尚未明確[17]。1997年Srinivasan等[19]研究猜測將SV40的T抗原片段整合到靶細胞核內進行表達，從而誘導細胞永生化，這可能是因為T抗原片段與pRB-E2F復合體結合，使E2F從pRB-LT復合體中分離出來，抑制細胞衰老，從而達到細胞永生化。2019年生立平等[20]證實SV40T能夠獨自使施旺細胞(SCs)啟動重編程，使SCs轉化為間充質干細胞。目前，研究者發現了很多將正常細胞通過SV40轉染成永生細胞株的方法，其中共培養野生型SV40病毒法感染靶細胞、磷酸鈣法、電穿孔以及逆轉錄病毒載體法等效果顯著[17]。

2.4 端粒-端粒酶激活誘導細胞永生化

端粒具有獨特的帽狀結構，它們存在于真核細胞染色體的頭端和尾端，由DNA序列和蛋白質構成。端粒長度約為5—15 kb，擔負重要的生理功能，包括維持染色體結構和位置的穩定性，防止化學酶降解染色體，調節細胞正常功能，決定細胞壽命等[21]。端粒長度與有絲分裂次數有關。體外培養的細胞分裂1次，端粒就會縮短50—200 bp[22]。所以端粒被稱為細胞壽命的“有絲分裂鐘”。而端粒酶是一種催化端粒自我復制并負責端粒的延長的逆轉錄酶。它也是調節細胞周期的重要生物因子。它的功能是通過轉錄自身的RNA序列形成一個新的端粒DNA序列，用來補充缺少的端粒，保持端粒的長度和細胞的無限分裂[17]。端粒酶是細胞永生化的關鍵。一般情況下，大部分的體細胞端粒酶在表達時是嚴格調控的，同時表達是低水平和瞬時的[23]。但在細胞永生化之后，其端粒酶的活性會明顯增強。研究發現，hTERT作為端粒酶的催化亞單位，與相關蛋白結合后可以激活端粒酶，延長體外細胞培養的生命周期[24]。它是端粒酶的正向調節因子[25-27]。利用端粒-端粒酶激活誘導細胞永生化是當前細胞永生化最有效的方法，應用最多的方法。但是該方法可以使大多數人類或動物細胞永生化，但是對于某些細胞來說，只憑借該方法不足以使細胞永生化，還需要其他方法輔助進行。

2.5 可回復性永生化

可回復性永生化的基本原理是將篩選的永生化基因導入至原代細胞，從而使原代細胞轉化為具有體外增殖能力的永生化細胞株，然后通過特異性位點重組技術切除永生化基因，使細胞株回復到初始原代細胞的狀態[28-32]，近年來出現的可回復性永生化技術將條件基因敲除技術Cre/Loxp系統與基因轉染技術相結合，誘導細胞永生化，提高細胞增殖能力，在擴增培養獲得足夠數量的永生化細胞后，利用位點特異性酶對基因組中的永生化基因進行再切除，實現了細胞永生化和可控回復性[33]。例如研究肝臟疾病首先需要理想的永生化肝細胞株，而傳統肝細胞株存在安全性及特異性功能分化較差的缺點，該方法為獲得理想肝細胞提供了新思路[27，34-35]。這樣不但克服了肝細胞的體外增殖，而且避免了安全性及功能分化差的缺點[36]。

各種細胞永生化方法比較如表1，通過表1可以看出自發突變以及化學致癌物、射線誘導細胞永生化缺點多、效果差，隨著科技的進步，已經逐漸被新技術取代。病毒感染誘導細胞永生化目前應用最廣，但普遍存在安全性及特異性功能分化較差、理想永生化少、針對性較強等缺點，且永生化基因長期存留在細胞內具有潛在的惡變風險。可回復性永生化既能使細胞無限增殖，又克服了細胞因永生化而發生惡性轉變、安全性差的缺點，但目前該方法只在肝細胞永生化上應用最多。而端粒-端粒酶激活誘導細胞永生化可使大多數人類或動物細胞永生化，且建立的永生化細胞可保持正常細胞的生理特性，但對于某些細胞來說，只憑借該方法不足以使細胞永生化，還需要其他方法輔助進行，利用端粒-端粒酶激活誘導細胞永生化是當前細胞永生化最有效的方法。

3 永生化細胞檢測方法

體外培養的永生化細胞除了具有無限增殖傳代的功能以外，其他細胞特性并未發生變化。目前對永生化細胞的鑒定方法如下。

3.1 檢測永生化細胞外源基因的整合與表達

運用DNA免疫印跡法檢測永生化細胞外源基因的整合與表達[14]，Southern-blot檢驗外源基因在基因組中的整合情況，Northern-blot檢驗外源基因是否能正常表達，如果可以正常表達，則會生成特異mRNA。Western-blot分析外源基因是否可以正常表達蛋白質。鑒定某些與該外源基因有關的基因來判斷該外源基因是否具有原有的細胞特性。

3.2 端粒酶活性的檢驗

具有較高端粒酶活性是永生化細胞的另一特點，通過檢驗端粒酶活性，可以對永生化細胞進行鑒定。以人外源端粒酶逆轉錄酶(hTERT)為例，運用PCR可以檢測hTERT基因整合，RT-PCR檢測hTERTmRNA表達，運用免疫細胞化學檢測外源hTERT蛋白質表達，可見hMSC-hTERT細胞核中存在大量黃褐色顆粒，hTERT表達呈陽性，而hMSC中hTERT表達呈陰性，證明外源hTERT已經整合到hMSC中，并可以穩定表達蛋白質[37]。

3.3 永生化細胞表面抗原的檢測

因其永生化細胞本有的細胞特性并未發生變化，所以永生化細胞仍有其特異的表面抗原標記，可用流式細胞術和免疫熒光技術對永生化細胞的表面抗原進行檢測。

3.4 永生化細胞功能的檢測

誘導具有分化潛能的細胞體外分化，觀察其分化能力。之后通過上述方法檢測永生細胞是否具有與體內原始細胞同樣的功能，另外，永生細胞不同于癌細胞，它不致癌，皮下注射可以用來檢測獲得的永生細胞是否致癌[17]。

4 結語與展望

細胞永生化是研究細胞增殖分化的理想模型，我們可以利用細胞永生化的各類方法使那些增殖分化困難易衰老的細胞獲得永生，從而為研究者提供更多的細胞資源。但目前仍有很多問題沒有解決，如雖然到目前為止細胞永生化的方法有很多，但是不同的細胞運用哪種永生化方法最有效沒有明確，細胞具體的衰老機制尚未摸清等。這些尚未解決的難題，在未來有必要開展特定的細胞研究，闡明每一種細胞不同的分子機制，這對于為生物實驗研究提供有力工具，為有效準確地診斷疾病提供新道路，有著不可或缺的作用，總之細胞永生化的應用前景廣闊，精確有效細胞永生化技術的建立對生物學、再生醫學、組織工程等學科的發展意義重大。