攜RHD-CE（2-9）-D基因并產生抗-D、抗-E抗體1例

權軍輝 張明剛 姜俠 韓梅寧

RHD-CE（2-9）-D屬融合基因[1，2]，為RHD基因的一種弱表現形式，常規血清學試驗常將其鑒定為RhD-。據文獻報道，Rh血型系統D抗原抗原性強于E抗原[3-6]，理論上機體接受D抗原和E抗原免疫性刺激后產生的抗體常規應該是抗-D強于抗-E。然而，我們臨床工作中遇到了抗-E（1∶512）強于抗-D（1∶64），與常規不符，探究詳情報道如下。

材料與方法

1 一般資料 63歲漢族女性，貧血入院，無輸血史，G6P3，長子出生1周夭折，此前三次妊娠均在60天左右不明原因流產，現一子（38歲）一女（34歲），均體健，血型均是O型RhD+，無黃疸等新生兒溶血病史。急診交叉配血發現其為O型RhD-，且主側不合。為明確原因做進一步血清學實驗、家系調查和PCR-SSP法RHD基因檢測。

2 試劑與儀器 凝聚胺介質試劑（珠海貝索生物技術有限公司，批號：119032）；單克隆抗-A抗-B（長春博德生物技術有限責任公司，批號：20180504），Rh（D）（IgM）（珠海貝索生物技術有限公司，批號：V194350），Rh（D）（IgG）抗血清（上海血液生物醫藥有限責任公司，批號：20181023）；抗體篩選細胞（上海血液生物醫藥有限責任公司，批號：20187010）；抗體鑒定譜細胞（sanquin，批號：8000247939）；Rh血型分型卡（江蘇力博醫藥生物技術有限公司，批號：201806010）；抗人球蛋白卡（達亞美，批號：20180528）；血液基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，批號：180097）；人類紅細胞RHD基因分型試劑盒（PCR-SSP法）（天津秀鵬生物技術開發有限公司，批號：SUPER008-002-011）；PCR擴增儀（PE9700，美國Applied Biosystems公司）。

3 方法 生理鹽水法、聚凝胺法、抗人球蛋白法及微柱凝膠法等均參考第四版《全國臨床檢驗操作規程》，PCR-SSP法遵照人類紅細胞RHD基因分型試劑盒說明書。PCR產物用2.0%瓊脂糖凝膠進行電泳。

結 果

1 ABO及Rh血型鑒定 試管法顯示患者ABO血型為O型，正反定型相符。微柱凝膠卡法給出Rh系統血型為Ccdee。

2 交叉配血 緊急搶救時與庫存僅有的2 U O型RhD-懸浮紅細胞交叉配血結果為：鹽水法相合；抗人球蛋白法主側不合，次側和自身對照均陰性。重復交叉配血實驗結果相同。對該獻血者紅細胞進行Rh分型檢測，結果為ccdEe。用已知Rh分型為ccdee和ccDee的O型懸浮紅細胞分別與患者標本做交叉配血試驗，結果前者相合，后者不合，初步推斷患者血清中有Rh系統IgG類抗-D、抗-E產生。

3 抗體鑒定 患者血清與3個抗體篩選細胞在鹽水介質中反應均為陰性，在抗人球介質中均顯示2+至4+凝集。為進一步確認抗體類型，將患者血清與16種譜細胞進行反應。結果鹽水介質下16種譜細胞均顯示陰性，抗人球蛋白微柱凝膠卡（表1）則提示存在抗-D、抗-E抗體。用聚凝胺法和抗人球蛋白法分別對抗體強度進行檢測，均為抗-D效價為1∶64，而抗-E效價可達1∶512，明顯強于前者。

4RHD基因檢測 本研究采用PCR-SSP法對患者RHD基因進行檢測，按試劑盒說明書對患者DNA進行擴增后，取PCR擴增產物5 μL進行電泳，結果如圖1所示。根據試劑盒提供的格局表可知，只有Exon1和845G有條帶者可判斷其基因型為RHD-CE（2-9）-D型。

5 家系調查 患者的一子一女的ABO血型一致，均為O型；Rh血型也一致，為CcDee。

表1 抗體鑒定結果

討 論

圖1 患者RHD基因檢測電泳圖譜

Rh血型系統D抗原和E抗原分別由RHD基因和RHCE基因表達產生，二者高度同源，位于1號染色體p34，均由10個外顯子組成，編碼區總長為1 251 bp，編碼417個氨基酸組成的糖蛋白[7，9]。RHD基因型有完整型（22.96%）、部分缺失型（21.48%）和全缺失型（55.56%）三種[10]，完整型表達D抗原的全部位點，其抗原性也是最強的；全缺失型不表達D抗原，即Rh（D）陰性；部分缺失型是其中復雜多變的一種，其表達的D抗原抗原性有強弱無之分，也是易造成Rh（D）假陰性的基因類型，也稱為“D變異體”。RHD-CE（2-9）-D是中國人部分D主要等位基因，位于cDe或（和）CDe單倍體中，因其2-9外顯子被同源RHCE基因替換而不能編碼正常RHD蛋白，形成個體D抗原陰性表型[11]。

文獻報道RHD-CE（2-9）-D基因型屬于無效基因[12，14]，因為其幾乎不表達D抗原，即可能是Rh系統D基因被CE基因過多融合而僅能夠微弱表達常規血清學無法檢出的D抗原，所以攜帶RHD-CE（2-9）-D基因型患者在接受抗原性強于它所表達D抗原的外源性D抗原免疫性刺激后可能會產生弱抗-D抗體，即表達弱D抗原機體在被強D抗原免疫性刺激后亦會產生抗-D抗體，但抗體的強弱由融合基因表達抗原的免疫原性及機體接受免疫性刺激抗原的免疫原性共同決定。本病例中患者之所以會出現弱抗-D強抗-E的現象可能是：①其攜帶RHD-CE（2-9）-D基因D抗原的弱表達所致，亦可理解為病例中非常規抗-D、抗-E的產生與其攜帶的RHD-CE（2-9）-D基因密切相關。相關程度的研究本應繼續基因測序試驗，但遺憾的是因實驗室條件所限，加之筆者初次做類似研究而經驗不足，標本儲存量和時間均不合格，因此患者去世后測序試驗無法進行；②結合病史資料和家系調查結果分析，患者六次妊娠史中接受E抗原免疫性刺激的機會可能多于D抗原，即前四次懷的可能是D抗原陰性而E抗原陽性的胎兒；③患者RhCc表型所致，有報道稱Cc的存在有時能夠使抗-D形成減弱[15]。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突