非霍奇金淋巴瘤患者行外周血單個核細胞采集前后血細胞的變化及影響因素分析

遲紅旭 江穎 姚歡 田靜 李玲玲 朱曉君 劉曉敏 張雷英 孫桂香 于洋

淋巴瘤為原發于免疫系統的實體腫瘤，其中霍奇金淋巴瘤與非霍奇金淋巴瘤的占比約為1:9。從病理學水平上劃分，非霍奇金淋巴瘤主要包括B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤以及NK細胞淋巴瘤，其中來源于B細胞的淋巴瘤占所有淋巴瘤的85%～90%[1]。目前，非霍奇金淋巴瘤的一線治療方案為化療，絕大部分的患者經一線治療后可獲得治愈，但仍有20%～30%的彌漫大B細胞淋巴瘤患者經化療后復發[2]。部分復發難治非霍奇淋巴瘤患者可通過自體移植獲得緩解，但大約有40%～50%的患者經自體移植后仍然復發。復發難治非霍奇淋巴瘤患者預后不佳，總體反應率（overall response rate，ORR）僅26%，中位生存期僅為6.3月[3]。

CAR-T療法（chimeric antigen receptor T-Cell immunotherapy），嵌合抗原受體T細胞免疫療法，即通過血細胞分離機體外采集患者自身的外周血，通過基因編輯工程使患者T細胞表面攜帶有針對腫瘤細胞抗原的特異性分子，靶向殺傷腫瘤細胞的新型免疫療法，于2017年已獲得美國食品藥品監督管理局（FDA）批準用于治療經一線以及二線治療失敗后的復發難治非霍奇金淋巴瘤[4]。新型免疫療法的出現成為了復發難治非霍奇金淋巴瘤患者的福音。患者在行CAR-T治療之前，由輸血科協助進行單個核細胞采集，現將擬行單個核細胞采集的非霍奇金淋巴瘤患者以及健康供者采集前后的血細胞變化進行分析，同時探討影響終產品單個核細胞數量的因素以更好的提高采集效率。

資料與方法

1 一般資料 選取2019年3月1日～2019年10月31日，在輸血科進行單個核細胞（MNC）采集的非霍奇金淋巴瘤患者23例及健康供者22例為研究對象。其中非霍奇金淋巴瘤Ⅰ/Ⅱ期患者6例；Ⅲ/Ⅳ期患者17例。研究對象的一般資料如表1所示。

納入標準：①體重：女≥45 kg，男≥50 kg；②血壓：90/60 mmHg～160/100 mmHg；心率：60～100次/分；③一般狀況良好；④血常規：血紅蛋白：女≥110 g/L，男≥120 g/L，血小板計數≥100×109/L；⑤心電圖各項參數檢測值在正常范圍；⑥凝血功能正常。排除標準：①嚴重心腦血管疾病；②活動性癲癇；③臟器功能衰竭；④凝血功能障礙伴活動性出血；⑤有嚴重的獻血反應史或遲發型昏厥史；⑥暈厥；⑦采集前8 h行增強CT或增強核磁檢查；⑧采集前有腹瀉。

2 儀器與試劑 COM. TEC血細胞分離機（德國Fresenius公司）；抗凝劑（四川南格爾生物科技有限公司）血液保存液（Ⅰ）500 mL，其主要組分為枸櫞酸鈉、枸櫞酸、葡萄糖；0.9%氯化鈉注射液（華仁藥業股份有限公司）；血常規以及產品血常規均由SysmexXS-800i系列全自動血液分析儀（Sysmex公司）進行檢測。

3 采集參數 首先依據患者的血常規結果以及機器的采血效率計算所需循環血量，采血流速一般設置為60 mL/min，全血與抗凝劑的比例為1∶10；采集過程中根據患者的癥狀調整補鈣的量以及速度，以減輕或避免枸櫞酸鹽反應（口唇麻木、四肢麻木、肌肉震顫或抽搐）；持續床旁心電監護，密切關注患者一般生命體征，治療過程中每隔20 min記錄患者血壓、心率、呼吸頻率，如發現不良反應及時上報臨床醫生。

4 檢測指標 采用血細胞分析儀，檢測采集前后患者/供者外周血細胞計數和終產品血細胞計數；記錄采集相關參數，包括采集時間、循環次數、單次循環量、總循環量、ACD用量、除去ACD的總循環量 、白膜泵出量、單次收集量、ACD：全血比值、流度；采集前/后單個核細胞計數=采集前/后淋巴細胞計數+采集前/后單核細胞計數；終產品單個核細胞計數=終產品淋巴細胞計數+終產品單核細胞計數。

5 統計學分析 應用Graphpad 8.0進行統計分析，計數資料以均數±標準差（ ±SD）表示，多因素回歸分析法進行多因素分析，篩出主要相關因素，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 非霍奇金淋巴瘤患者和健康供者的基本情況比較非霍奇金淋巴瘤供者和健康供者基本情況比較見表1。

2 采集過程中的采集參數情況 采集過程中非霍奇金淋巴瘤患者和健康供者采集參數見表2。

3 采集單個核細胞前后血細胞的變化

3.1 健康供者采集前后血細胞變化情況：行單個核細胞采集后，健康供者RBC、WBC、淋巴細胞、單核細胞、PLT均較采集前明顯下降（圖1）。其中，WBC和單核細胞較采集前平均下降約18%；RBC和PLT較采集前平均下降約20%；血紅蛋白較采集前平均下降約21%；淋巴細胞較采集前平均下降約24%。

3.2 非霍奇金淋巴瘤患者采集單個核細胞前后血細胞的變化：非霍奇金淋巴瘤患者行單個核細胞采集后，白細胞、淋巴細胞、單核細胞、紅細胞及血紅蛋白計數較采集前明顯下降（圖2A、2B、2C），但血小板計數較采集前無明顯變化（圖2D）。其中，白細胞、紅細胞、血紅蛋白采集后較采集前下降約15%，淋巴細胞較采集前下降約16%，單核細胞較采集前下降約13%。

表1 兩組人群基本情況比較

表2 非霍奇金淋巴瘤患者和健康供者的采集參數比較 （ ±SD）

圖1 健康供者采集前后血細胞的變化情況

3.3 非霍奇金淋巴瘤患者與健康供者對比采集前后血細胞的變化：非霍奇金淋巴瘤患者采集單個核細胞前，白細胞計數、單個核細胞計數均較健康供者低（圖3A、3C），采集后非霍奇金淋巴瘤患者白細胞計數、單個核細胞計數均低于健康供者（圖3B、3D）。

圖2 非霍奇金淋巴瘤患者采集前后血細胞的變化情況

圖3 非霍奇金淋巴瘤患者與健康獻血者采集前后血細胞的變化

3.4 影響終產品單個核細胞數量的因素相關性分析：通過相關性分析發現，采集前單個核細胞的數量、采集前白細胞計數、采集時間、白膜泵出量、單次收集量、循環次數、單次循環量、總循環量與終產品單個核細胞數量呈現明顯的線性相關。其中，隨著單次循環量的增加，終產品單個核細胞數量（終產品單個核細胞濃度×終產品體積）呈現下降趨勢；采集前MNC（包括淋巴細胞和單核細胞）的數量、采集前白細胞計數、采集時間、白膜泵出量、循環次數、總循環量與終產品MNC數量呈現明顯的正向相關。而年齡、身高、體重、BMI、全身循環血量、流速與終產品MNC數量無明顯相關性。

3.5 影響終產品MNC數量的多元線性回歸分析：通過對影響終產品MNC數量的因素進行多元線性回歸分析發現單次收集量、循環次數以及采集前MNC計數是影響終產品MNC計數的因素。回歸系數如表3所示，回歸方程為?=0.617a1+0.410a2+0.274a3，a1為單次收集量，a2為循環次數，a3為采集前MNC計數，回歸方程檢驗的P＜0.05，顯示有統計學意義。

圖4 影響最終產品MNC計數的相關因素分析

表3 MNC采集的多元線性回歸分析

討 論

近年來，CAR-T療法在非霍奇金淋巴瘤中得到了廣泛應用[5]。在進行CAR-T治療之前，首先需要進行MNC采集，從外周血中分離獲得富含MNC的細胞產品，經體外活化，基因編輯修飾，體外擴增，使T細胞穩定表達與靶抗原特異性結合的抗體，從而以非

MHC（major histocompatibility complex）限制性的方式特異殺傷靶抗原[6]。經血細胞分離機獲得的富含MNC產品中MNC的數量是保證CAR-T治療有效性的關鍵因素。我們選取了23名擬行CAR-T治療的非霍奇金淋巴瘤患者以及22名健康供者進行MNC采集，分析采集前后的血細胞計數變化，為MNC采集機采條件提供依據，同時，總結影響終產品MNC數量的因素以更好的提高采集效率。

本研究的結果顯示，無論是健康供者還是非霍奇金淋巴瘤的患者，進行MNC采集后，血細胞計數較采集前均會下降，健康供者血細胞下降幅度波動于18%～24%，平均下降約21%（圖1）；非霍奇金淋巴瘤患者血細胞下降幅度波動于13%～16%，平均下降約14.5%（圖2）。健康供者與非霍奇金淋巴瘤患者相比，采集MNC后血細胞水平下降幅度較大。采集完成后血細胞的下降幅度與采集前血細胞計數水平密切相關，采集前非霍奇金淋巴瘤患者血細胞計數水平明顯低于健康供者（圖3），因而健康供者完成MNC采集后血細胞的下降水平較非霍奇金淋巴瘤患者下降幅度大。該結果提示我們在獲得高質量的MNC產品同時，為保障供者及患者的健康水平，采集前選擇外周血細胞計數較高的供者進行采集。

造成非霍奇金淋巴瘤患者血細胞計數水平明顯低于健康供者（圖3）的原因可能與入組的非霍奇金淋巴瘤患者皆為經傳統一線治療失敗后的復發難治患者，行MNC采集前經歷了多療程化療有關。文獻報道[7]亦證實多療程的放化療會影響血細胞計數。因此，非霍奇金淋巴瘤患者，采集MNC之前可進行細胞動員，促進骨髓中的MNC釋放入血，以獲得更好的細胞產品。

為提高采集效率，保證產品質量，將采集前的血細胞計數，采集過程中的參數設置與終產品MNC數量進行相關性分析發現，采集前MNC計數＞2×109/L，白細胞計數＞4×109/L（圖4A、4B），終產品中MNC計數較理想，該結果與國內陸華等[8]報道較為一致。

張根玲等[9]研究發現在兒童造血干細胞自體采集的患者中，終產品MNC計數與采集前集落刺激因子動員后的MNC數量有相關性。也有研究得出[10]終產品MNC計數與采集前WBC總數有關。本研究顯示采集前MNC與終產品MNC計數呈正相關，而前期研究[11，12]發現終產品MNC與采集前淋巴細胞計數有相關性，分析原因可能是COM.TEC血細胞分離機是通過梯度密度離心方式將全血分離成不同的血液成分，通過界面探測器識別MNC進行提取，而單核細胞或淋巴細胞等單一因素可能不會影響終產品MNC數量，但此結果需擴大樣本量后進一步證實。此外，本研究還發現采集者的身高、體重、BMI、全身循環血量不影響終產品MNC計數。除采集前血細胞計數外，機器參數設置也是影響外周血MNC細胞采集的主要因素。其中，隨著采集時間、白膜泵出量、單次收集量、循環次數、總循環量的增加，終產品中MNC細胞數也隨之增加（圖4C-G）。然而，單次循環量增加，終產品單個核細胞計數并未增加，反而呈現下降趨勢。單次循環血量控制在400～600 mL，即可獲得高濃度的細胞產品（圖4H）。單次收集量、循環次數以及采集前MNC細胞計數，三者之間互相制衡，共同影響最終產品中MNC細胞計數。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突