不同來源復水液對凍干PRP活化和釋放生長因子影響的比較*

林放 周謀 單桂秋 李艷輝 李文丹

富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是全血經離心后得到的一種血小板濃縮物，其中含豐富的生長因子，在促進創面愈合和抑菌抗炎中發揮著重要的作用。由于PRP的保存時間短，受環境因素影響容易被激活或污染，降低了其應用價值。

對PRP進行凍干，能使PRP在常溫條件下保存，所占空間小，還便于運輸。凍干PRP一般用貧血小板血漿（platelet-poor plasma，PPP）進行復水化[1-3]，但使用前需要分離制備PPP，不僅操作繁瑣，對制備環境要求高，還有患血液傳染病的風險。為了讓凍干PRP復水化的步驟變得更簡便、安全，本實驗研究了不同成分的復水液，并對復水化后的凍干PRP活化和釋放生長因子效果進行比較。現將研究結果報告如下。

材料與方法

1 試劑和儀器

1.1 試劑：TGF-β1 ELISA試劑盒（RayBio，批號0615180188）、VEGF-A ELISA試劑盒（RayBio，批號0504180196）、PDGF-BB ELISA試劑盒（RayBio，批號0615180180）、bFGF ELISA試劑盒（RayBio，批號0608180107）、P-Selectin（RayBio，批號1026180217）、CD63（RayBio，批號1214182471）、生理鹽水（醫院自制，批號18041122）、PBS緩沖液（Thermo Fisher Scientific，批號8118177）、血細胞分析儀用溶血劑（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，批號2017122401）、血細胞分析用稀釋液（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，批號2018033102）等。

1.2 儀器：酶標儀（賽默飛世爾（上海）儀器有限公司，型號Multiskan Mk3）、血細胞分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，型號BC-3000 plue）、超純水機（廣州譽維生物科技儀器有限公司，型號Unique-S）、真空冷凍干燥機（德國Christ公司，型號Alpha1-4lsc Plus）等。

1.3 富血小板血漿來源：來自2018年8月在南部戰區總醫院血液中心獻血的健康無償獻血者，獻血前3日未服用阿司匹林或阿司匹林類藥物，并進行HBsAg、抗-HCV、抗-HIV和抗-TP等輸血相關性傳染病檢測。用ACD五聯血小板采集袋采集8人份O型全血（400 mL），匯集成1份血小板，6 h內采用白膜法制備濃縮血小板，并調節匯集血小板計數至800×109/L，（22±2）℃振蕩搖床過夜，使其解聚。

2 方法

2.1 血小板凍干預處理液的配制：精確稱量NaCl 3.214 g，KCl 0.157 g，CaCl20.078 g，MgSO40.271 g，NaHCO32.604 g，檸檬酸 0.714 g，檸檬酸鈉1.970 g，乙酸鈉1.230 g，葡萄糖2.120 g，海藻糖17.117 g，用超純水溶解，定容至1 L。加入1 μl/mL可逆性血小板激活抑制劑PGE1，調節pH至6.6～6.8，0.22 μm濾器過濾。

2.2 凍干緩沖液配制：在上述血小板凍干預處理液中加入30%蛋白質類保護劑，3 000 r/min離心20 min，移出上清，調pH為6.6～6.8，0.22 μm濾器過濾。

2.3 血小板凍干前預處理：將匯集血小板，3 000 r/min離心20 min，移上清留沉淀，用與移去上清同體積的預處理液重懸血小板，37℃振蕩水浴4 h，使血小板保持懸浮狀態。水浴后，將血小板懸液再以3 000 r/min離心20 min，棄上清留沉淀，用與棄去上清同體積的凍干緩沖液重懸血小板。

2.4 血小板懸液凍干：將預處理后血小板懸液轉移到凍干瓶（硅化玻璃瓶）中，每瓶4 mL（厚度不超過1.5 cm），置于-80℃超低溫冰箱中預凍過夜，次日先將凍干機打開，使冷阱溫度降至-46℃后，將凍干樣品從冰箱取出移入凍干機并開始進行真空干燥，保持真空度為＜133 mbar，真空干燥24 h后取出，密封后置于室溫干燥處保存。

2.5 凍干PRP復水化及激活：按復水液的種類，將實驗分成生理鹽水組、超純水組和PBS緩沖液組，將PPP復水液設為對照組。凍干PRP分別用4 mL的PPP、生理鹽水、蒸餾水和PBS緩沖液進行一步法復水，使其體積與凍干保存前血小板懸液相同體積，輕輕振蕩搖勻至凍干粉完全溶解。

凍干PRP完全復水化，將200 U凝血酶凍干粉溶于2 mL的葡萄糖酸鈣注射液中，置37℃水浴30 min，充分激活后以3000 r/min離心20 min，分裝上清至EP管中待檢[4，5]。

2.6 復水后PRP凝血功能和生長因子含量檢測：按照分組，對凍干PRP進行復水化，并用ELISA法檢測復水后PRP中P-Selectin（P-選擇素）、CD63、血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor VEGF）、胰島素樣生長因子I（insulin-like growth factor-I，IGF-I）、堿性成纖維細胞生長因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）、血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、轉化生長因子β（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的含量，具體實驗步驟參照試劑盒提供的說明書進行操作。

3 統計學處理 各組別的比較，采用SPSS 18.0軟件進行統計分析，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），當方差齊時，進一步采用LSD分析結果，當方差不齊時，Dunnett T3分析結果，P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 復水后PRP理化性質檢測結果 由圖1可見，PPP、生理鹽水和PBS緩沖液可以將凍干PRP復水化成液體，但用超純水復水化的凍干PRP有較多絮狀物，離心后立即凝集成凝膠。

2 復水后PRP凝血功能和生長因子含量檢測結果 各組凍干PRP復水后，我們用ELISA法檢測了P-Selectin、CD63、PDGF-BB、TGF-β1、VEGF、EGF、IGF-I 及FGF-b的含量。由表1可知：P-Selectin、VEGF-A含量：生理鹽水組、超純水組和PBS緩沖液組均高于PPP組，差異無統計學意義（P＞0.05）。CD63含量：生理鹽水組高于PPP組，超純水組和PBS緩沖液組均低于PPP組，差異無統計學意義（P＞0.05）。IGF-I含量：生理鹽水組、超純水組和PBS緩沖液組均低于PPP組，差異有統計學意義（P＜0.05）。bFGF、PDGF-BB、TGF-1β含量：生理鹽水組、超純水組和PBS緩沖液組均低于PPP組，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 凍干PRP復水化后外觀

表1 各組凍干PRP復水化后生長因子含量

討 論

PRP對急、慢性創面都有良好的促進愈合和抗感染功能，在臨床上廣泛使用。PRP制備后，需立即使用，且無法長期保存，因此在臨床推廣受到了一定的限制，將血小板進行凍干，可解決血小板只能短期保存的缺點[6]。凍干后的血小板，常溫下可長期保存，質量輕，方便攜帶，需要時使用復水液進行復水化，即可使用。本實驗為了進一步驗證PRP凍干后的效果，使用的是一年前凍干并常溫保存的凍干PRP。

貧血小板血漿（platelet-poor plasma，PPP）是目前普遍使用的凍干PRP復水液[7-10]，使用前需要分離制備，血漿有污染的風險，因此對制備環境要求較高，加上血液有窗口期，使用PPP進行復水化，也增加了患血液傳染病的風險。生理鹽水是一種生理學實驗或臨床上常用的滲透壓與動物或人體血漿的滲透壓基本相等的氯化鈉溶液；超純水是蒸餾、去離子化、反滲透技術生產出來的水，無礦物質微量元素和細菌、病毒、含氯二噁英等有機物；PBS緩沖液是一種磷酸鹽緩沖液，起溶解保護試劑的作用，主要成分為Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl[11]。雖然臨床上已經通過實驗證實PPP做為復水液，血小板的回收率最高[12]，但以上三種溶液和PPP相比，有來源安全、沒有血液傳染病和使用時不需制備等優點。為此，本實驗將生理鹽水、超純水和PBS緩沖液作為凍干PRP的復水液，并以PPP作為對照，探討用其他溶液代替PPP作為凍干PRP復水液的可靠性。

P-Selectin是血小板活化的特異性標志物[13]，CD63是活化血小板表面的抗體，反映體內血小板活化程度[14]，這兩個指標都與相應血小板體內存活率和存活期呈負相關[15]。為此，我們選擇了其作為檢測復水化后血小板功能的檢測指標，探討不同復水液對血小板凝血功能的影響。本實驗的檢測結果顯示，生理鹽水、超純水和PBS緩沖液作為復水液，P-Selectin和CD63的數值稍高于PPP，但無統計學差異。這說明這三種復水液在復水化的過程中，血小板被激活的程度略高于PPP，但在血小板的聚集反應和促凝血活性功能上與使用PPP復水后無差異。

VEGF-A、IGF-1、bFGF、PDGF-BB、TGF-1β這五種生長因子是PRP中含量較高的生長因子，為此我們將其作為檢測指標，探討各種復水液對釋放生長因子效果的影響。本實驗的檢測結果顯示，三種復水液的生長因子含量均低于PPP組，除IGF-I含量差異有統計學意義外，其余四種生長因子的含量與PPP組相比均無統計學意義。這說明，這三種復水液的釋放生長因子效果并不差于PPP，更不影響凍干PRP在后續使用時，促進細胞增殖、血管形成和細胞外基質沉積的作用。但我們在實驗中發現，超純水作為復水液，會迅速激活凍干PRP中的血小板，使復水化后的PRP形成了凝膠狀，無法進行下一步的制備或注射，其原因還需進一步研究。

從上述的結果我們初步可知，生理鹽水、超純水和PBS緩沖液作為凍干PRP的復水液，在凝血和促進創面愈合的功能上，并不差于PPP，均可替代PPP。但超純水會將凍干PRP復水化成凝膠，因此本實驗初步確定生理鹽水和PBS緩沖液都是凍干PRP的較理想的復水液，但對血小板功能活性的影響還需要進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突