Notch信號通路活化協同巨噬細胞對膽道閉鎖肝纖維化的作用研究

阿里木江·阿不都熱依木 林 峰 王皓潔 李 鑫 趙一霖 劉更新 詹江華 賈金富

膽道閉鎖(biliary atresia,BA)是一種由肝外膽管梗阻引起的嚴重肝膽疾病，以進行性肝纖維化為特征，最終可導致肝硬化，其病因復雜，至今仍未明確[1]。肝門空腸吻合術(Kasai術)是有效的治療方式，如果不治療，患者很快進展為終末期肝硬化，可危及生命[2]。然而，術后仍有部分患者因進行性肝纖維化導致肝硬化而需肝移植[3,4]。因此，BA患者不可抑制的肝纖維化是治療的重中之重，迄今為止，其纖維化的病理機制仍處探索之中。前期研究表明Notch信號通路與BA肝纖維化有一定關系，但具體機制尚不完全清楚[5]。鑒于BA患者肝臟發生持續性的炎性纖維化，Notch信號通路的Delta樣配體4可以促進巨噬細胞的活化[6,7]，本文將探究Notch信號通路活化及相關炎性反應分子機制在膽道閉鎖肝纖維化進展中的作用。

材料與方法

一、臨床資料

選取2019年1月至2020年11月于天津市兒童醫院經膽道造影及肝活檢確診為Ⅲ型BA、并行Kasai術及肝活檢術的15例BA患者的肝臟活檢組織(BA組)進行研究，15例中男8例，女7例，年齡1～4個月。因先天性膽總管擴張(congenital biliary dilatation,CBD)和BA患者都需手術引流膽汁，但臨床預后截然不同。故選擇同時期于本院行膽管空腸吻合術及肝活檢術的1歲以內CBD患者肝活檢組織作為對照組(CBD組)，其中男2例，女3例，年齡為2～6個月。兩組患者年齡和性別分布無統計學差異(P>0.05)。根據Ohkuma’s分級標準，將纖維化Ⅰ級和Ⅱ級分為輕度肝纖維化組，纖維化Ⅲ級和Ⅳ級視為重度肝纖維化組，其中輕度肝纖維化5例，重度纖維化10例。

所有活檢樣本均進行福爾馬林固定后用石蠟包埋保存備用。本臨床研究通過天津市兒童醫院倫理委員會批準(編號：L202011)。

二、實驗方法

1. 主要試劑：Anti-HES-1、Anti-IL-6及二氨基聯苯胺(diaminobenzidin,DAB)顯色液，均購自北京博奧森試劑有限公司；Anti-CD163及枸櫞酸鈉緩沖液均定購于北京中杉金橋試劑有限公司；Anti-PDGF-AA購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國Celplor公司。

2. Masson染色：將收集的患者肝組織進行石蠟包埋后連續切成4 μm的薄片，二甲苯脫蠟后經梯度酒精至蒸餾水，切片至蘇木精水溶液中染色5 min，酸水及氨水中分色，流水沖洗后，Masson 麗春紅染色5 min，以2%冰醋酸水溶液浸洗1 s，1%磷鉬酸水溶液分化3 min，苯胺藍染5 min。以0.2%冰醋酸水溶液浸洗1 s，脫水透明后封片。

請兩位專業病理科醫師在光學顯微鏡下觀察染色結果，膠原纖維呈藍色，胞漿、肌肉呈紅色，胞核黑藍色。根據Ohkuma’s分級標準進行纖維化分級。分級標準如下：0級為無纖維化；Ⅰ級為肝匯管區輕度纖維化；Ⅱ級為伸向鄰近門管區的輕度橋接纖維化；Ⅲ級為伸向鄰近門管區的重度橋接纖維化；Ⅳ級為有假小葉形成。

3. 免疫組化 所有患者的石蠟切片脫蠟后進行抗原修復，室溫下羊血清封閉抗原30 min，滴加一抗后，4℃孵育過夜，取出后恢復室溫，PBS緩沖液沖洗震蕩3次，滴加二抗，室溫下孵育30 min，PBS緩沖液沖洗震蕩3次后進行DAB顯色，鏡下控制顯色。顯色滿意后，用蘇木精復染細胞核，用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

染色結束后在光學顯微鏡下觀察染色結果，以黃棕色、棕褐色為陽性。先于40倍鏡下觀察每張切片陽性區域，后調整至200倍鏡下選擇5個不同視野拍照取圖。最后采用Image-Pro-Plus 6.0圖像分析系統進行半定量分析，結果以陽性面積的平均光密度值(average optical density,AOD)來表示(AOD=肝組織陽性細胞光密度總和/陽性面積)。

三、統計學方法

結 果

一、免疫組化染色結果

1. Notch信號通路效應分子HES-1的表達 ：HES-1在兩組肝活檢組織中的肝細胞胞漿及膽管細胞的胞漿、胞核均有表達，尤其以膽管細胞核為主。隨著肝纖維化程度的加重，匯管區的炎性細胞大量聚集，其周圍的肝細胞核呈現弱陽性或陽性。與CBD組相比，BA組的肝組織中HES-1的表達更強(圖1)。

2. CD163的表達：CD163在兩組肝組織的肝竇內巨噬細胞呈強陽性表達，匯管區部位CBD組有少量陽性表達，BA組呈明顯強陽性表達(圖2)。

3. IL-6與PDGF-AA的表達：IL-6在鏡下呈分泌型蛋白特征，在肝細胞、膽管細胞、炎性細胞胞漿中均有表達，且BA組的表達高于CBD組，在BA亞組中，纖維化嚴重患者肝臟的表達更強(圖3)。在顯微鏡下觀察可見，BA組的肝組織分泌PDGF-AA量相較于CBD組明顯增加，膽管細胞的胞核呈明顯強陽性，小葉間動脈呈明顯強陽性表達(圖4)。

圖1 HES1在兩組患者肝活檢組織中的表達情況(×200倍鏡) 注 1A：CBD組； 1B：輕度肝纖維化BA組； 1C：重度肝纖維化BA組；黃色箭頭為HES1陽性膽管細胞 圖2 CD163在兩組患者肝活檢組織中的表達情況 (×200倍鏡) 注 2A：CBD組； 2B：輕度肝纖維化BA組； 2C：重度肝纖維化BA組；黃色箭頭為CD163陽性細胞 圖3 IL-6在兩組患者肝活檢組織中的表達情況 注 ×100(100倍鏡下)；×200(200倍鏡下)； 3A/A’：CBD組； 3B/B’：輕度肝纖維化BA組； 3C/C’：重度肝纖維化BA組。黃色箭頭是肝細胞胞漿中IL-6陽性顆粒 圖4 PDGF-AA在兩組患者肝活檢組織中的表達情況 注 ×40(40倍鏡下)；×100(100倍鏡下)；×200(200倍鏡下)； 4A/A’：CBD組； 4B/B’：輕度肝纖維化BA組； 4C/C’：重度肝纖維化BA組；黃色箭頭是陽性的膽管細胞，綠色箭頭是小葉間動靜脈

二、免疫組化的半定量分析結果

1. 與CBD組相比，BA組的HES1、CD163、PDGF、IL-6的表達明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者肝組織HES1、CD163、PDGF-AA、IL-6表達水平比較(x±s)Table 1 Comparing the expressions of HES1,CD163,PDGF-AA and IL-6 in liver tissues of two groups分組HES-1CD163PDGF-AAIL-6CBD0.044±0.0170.089±0.0200.155±0.0190.070±0.007BA0.143±0.0270.259±0.1110.220±0.0440.216±0.028t值-7.520-5.651-3.144-18.268P值<0.001<0.001 0.006<0.001

2. HES1的表達與CD163及PDGF-AA、IL-6的表達呈正相關，見圖5。

圖5 肝臟HES1與CD163、PDGF-AA、IL-6的表達相關性 注 AOD平均光密度值。(左)Pearson相關分析，M2巨噬細胞的聚集與HES-1呈正相關，r=0.687，P<0.01。(右)Pearson相關分析，M2巨噬細胞分泌的PDGF-AA、IL-6與HES-1呈正相關。r=0.629，P<0.0001，r=0.880，P<0.0001

3. HES1、CD163、PDGF-AA、IL-6的表達與纖維化程度呈明顯正相關，四種蛋白均隨著纖維化程度的加重而表達增加(表2)。

表2 不同肝纖維化程度下HES1、CD163、PDGF-AA、IL-6表達水平情況(x±s)Table 2 Expressions of HES1,CD163,PDGF-AA and IL-6 in different fibrotic degrees(x±s)肝纖維化程度HES-1CD163PDGF-AAIL-6無0.044±0.0170.089±0.0200.155±0.0190.070±0.007輕度0.113±0.0100.138±0.0230.174±0.0120.177±0.002重度0.157±0.0200.319±0.0830.243±0.0350.235±0.003rs值 0.920 0.912 0.887 0.920P值<0.001<0.001<0.001<0.001

討 論

膽道閉鎖是一種嚴重的炎癥性纖維化性肝膽疾病，其病理特征為肝內膽管增生及不可逆轉的進行性肝纖維化，以Ⅲ型閉鎖最為多見，且預后最差。患者臨床表現為膽汁淤積性黃疸、大便顏色變淺、尿色加深等。結合腹部超聲、肝功能指標等輔助診斷手段，于腹腔鏡探查術中行膽管造影及肝活檢術可確診為BA[8]。肝門空腸吻合術雖可改善膽汁引流，但術后仍可能因肝纖維化進行性加重，導致患者最終需行肝移植術以延續生命[9]。只有揭開進行性肝纖維化機制的神秘面紗，才有可能從根本上解決臨床治療難題。新近膽道閉鎖發病機制研究在炎癥細胞方面取得了重大突破，對B細胞的干預有可能抑制BA的疾病進展[10]。本研究從Notch信號通路與肝臟炎性細胞的關系探究對BA肝纖維化的影響。

一、HES-1促進膽道閉鎖肝纖維化進展

Notch信號通路是膽道系統發育和肝纖維化相關的信號通路之一，膽管發育中的膽管板重塑和小管形成有賴于Notch信號通路的活化[11,12]。小兒肝膽畸形疾病中的Alagille 綜合征，大多是由于編碼Notch通路配體的Jag1基因或受體Notch 2存在致病性突變[13]。前期，本團隊初步探究發現Notch信號通路元件Notch1、Jagged1等的異常活化參與了BA肝纖維化進程，而HES-1是Notch信號通路下游主要的效應分子，其作為核轉錄因子，在信號傳導過程中，輔助相應的蛋白進行轉錄表達[5]。有研究表明HES-1可直接參與細胞外基質蛋白的產生，尤其在信號通路活化增強時，會增加α平滑肌動蛋白(α-Smooth mucle actin,α-SMA)和Ⅰ型膠原α2的啟動子活性，加劇膠原蛋白的積累，而選擇性地抑制HES-1或將HES-1維持在合理水平,會降低α-SMA和Ⅰ型膠原α2的啟動子活性[14]。本研究發現，BA肝組織中HES-1的表達水平比對照組CBD患者明顯增高，說明在同樣需要手術進行膽汁引流的膽道畸形疾病中，Notch信號通路的活化程度在BA肝組織中更強。此外，根據Ohkuma’s分級標準，本研究納入的對照組CBD患者均未發生肝纖維化，而BA組患者均發生了不同程度的肝纖維化。相關性分析顯示Notch信號活化后的效應分子HES-1的表達過高與肝纖維化程度呈正相關。由此可推測BA患者肝臟中Notch信號通路的異常活化導致了HES-1的過度表達，累及細胞外基質，從而加劇患者肝纖維化進程。

二、M2型巨噬細胞在BA患者肝臟的累積與Notch通路活化相關

巨噬細胞是肝臟組織多種穩態和病理反應的關鍵組成部分，其在慢性肝損傷的發病機制中起核心作用，已被認為是對抗纖維化的潛在靶點[15]。特定的環境信號決定了肝巨噬細胞的極化和功能。這些細胞可能促進肝損傷或感染后組織完整性的恢復，也可能加快肝臟疾病的進展[16]。本研究中免疫組化定位及半定量結果顯示，與CBD患者相比，CD163的表達在BA患者肝臟中明顯升高。CD163是M2型極化的巨噬細胞的標志物，即M2型巨噬細胞在發生肝纖維化的BA組聚集更加明顯，尤其在匯管區纖維增生部位。該結果與Yang等[17]對巨噬細胞的極化在BA肝纖維化的研究有相似之處，M1型巨噬細胞促進炎癥反應的作用更為明顯，M2型巨噬細胞抑制炎癥，促進修復，但是M2型巨噬細胞加劇了肝纖維化的進程。經統計分析，CD163與HES-1的表達水平呈正相關，即隨著肝纖維化程度的加重，HES-1與CD163的表達也隨之增加。有文獻報道，活化的巨噬細胞中Notch1和HES-1均被活化，進而通過激活NF-kappa B調節參與炎癥反應的基因表達模式，經Notch1的抑制劑γ分泌酶抑制劑(gamma-secretase inhibitor,GSI)處理后，巨噬細胞分泌的腫瘤壞死因子α，IL-6及IL-10均受到影響[18]。說明在BA患者肝臟中，Notch信號通路的活化參與調節巨噬細胞的功能狀態。

三、巨噬細胞的功能狀態對BA肝臟的影響

單核巨噬細胞可分泌轉化生長因子-β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)和血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factors,PDGFs)，介導肝星狀細胞轉化為肌成纖維細胞，分泌大量細胞外基質蛋白，促進肝纖維化的進展[19-21]。PDGFs共有5種生物活性PDGF蛋白， 4種同源二聚體(PDGF-a,PDGF-b,PDGF-c和PDGF-d)，1種異源二聚體PDGF-ab，其中PDGF AA主要與PDGFR-αα結合，與細胞的增殖和趨化作用相關[22]。膽道閉鎖是一種炎癥持續存在的進行性肝纖維化的肝膽疾病，而IL-6是持續炎癥伴發纖維化進展的依賴性細胞因子，可由巨噬細胞分泌，反映慢性肝病患者炎癥狀態[23]。此外，IL-6可作為BA繼發肝硬化時肝臟硬化程度的生物標志物[24]。本研究檢測到IL-6及PDGF-AA在BA組中表達明顯高于CBD組，且輕度和重度肝纖維化BA患者的HES-1與CD163的表達及IL-6和PDGF-AA的分泌量差異均具有統計學意義。說明在BA患者肝臟中，IL-6及PDGF-AA的過表達可促進肝纖維化進程，Notch信號對巨噬細胞有調節作用，而其分泌功能對BA肝纖維化起到促進作用。與此相似的一項新近研究指出原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)患者外周血巨噬細胞中的Notch1、Notch3受體表達異常，且M2型與M1型巨噬細胞數量比值與Notch受體表達水平呈線性相關[25]。成人PBC與嬰幼兒BA有一定的相似之處，肝臟小葉間膽管上皮細胞發生變性、壞死及炎癥細胞浸潤引起的肝內小膽管進行性破壞伴門脈炎癥性改變，最終導致膽汁淤積性肝纖維化。可見，Notch信號通路與巨噬細胞的密切聯系在促進肝纖維化方面的確具有重要作用。

綜上所述，Notch信號通路的異常激活參與了膽道閉鎖肝纖維化進程，肝臟M2型極化巨噬細胞浸潤，導致促進纖維化的炎性因子進一步積累，促進BA肝纖維化。但是，本研究還存在一定局限性，文中相關的分子表達情況只是提示Notch信號通路的異常參與BA的肝臟病理進展，尚不能提供強有力的佐證，需要進一步深入研究。為闡明該信號通路與BA肝纖維化機制的確切關系，還需進行細胞及個體的干預實驗進一步證實。目前，BA的發病機制在炎癥反應方面取得了重大突破。本研究也提出Notch信號通路與巨噬細胞的交互作用，促進BA肝纖維化進程，未來將進一步探究Notch信號通路活化對膽道閉鎖肝臟纖維化的影響。因此，Notch信號通路活化一方面可以調節炎癥細胞的功能狀態，另一方面可能參與增生膽管細胞發生上皮間質轉化，為進一步揭示膽道閉鎖進行性肝纖維化的發生機制提供新的方向。