高通量測序研究不同程度間歇性低氧致大鼠腸道微生物菌群改變 *

李 雯,趙 丹，萬自芳，張湘燕△

(1.貴州醫科大學,貴陽 550004；2.貴州省人民醫院呼吸與危重癥醫學科/貴州省人民醫院肺臟免疫性疾病重點實驗室，貴陽 550002)

慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)是阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS)特有的特殊低氧模式[1]。OSAHS是臨床常見的綜合征,目前普遍認為其是一種全身性疾病，可致多器官損害,是高血壓的致病因素，也是中風、缺血性心肌病、心力衰竭、心律失常、糖尿病等疾病的獨立危險因素[2]。腸道微生物作為人或動物的“共生體”，輔助宿主進行營養吸收和能量代謝[3]。正常生理狀態下腸黏膜處于高灌注狀態，對缺血、缺氧十分敏感，機體整體或腸道缺血、缺氧的狀態會直接損傷腸黏膜，進一步影響腸道微生物的定殖[4]。CIH所致睡眠剝奪可引起多種應激反應，目前認為腸道菌群移位所致的菌血癥和毒素血癥是應激反應惡性發展的主要原因，睡眠剝奪可影響大鼠腸道菌群，促進有害的產氣莢膜梭菌增殖[5]。本研究采用高通量測序研究不同程度CIH條件下大鼠腸道微生物菌群的改變。

1 材料與方法

1.1 建模及分組

選取健康清潔級雄性Sprague Dawley大鼠30只分為CIH組[A組(O28% 4周)、B組(O28% 8周)]和對照組，每組10只。CIH組大鼠循環給予氮氣和氧氣充入培養艙，每次循環2 min，維持氧濃度在8% 30 s，恢復氧濃度21% 60 s，每天造模8 h；A組造模4周，B組造模8周。對照組放置于常氧環境飼養8周。留取大鼠糞便樣品，用75%乙醇消毒大鼠肛周皮膚，刺激其排便，使用滅菌鑷子從大鼠肛門部取出糞便保存于無菌EP管，隨后迅速投入液氮，-80 ℃保存至備用。B組大鼠飼養過程中死亡2只，對總體實驗測序無影響。

1.2 測序方法

根據E.Z.N.A.?soil試劑盒對大鼠腸道樣品進行DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量；338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對V3、V4可變區進行PCR擴增，擴增程序：95 ℃ 預變性3 min，27個循環(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s)，最后72 ℃延伸10 min，PCR儀采用ABI GeneAmp?9700型。擴增體系：20 μL，4.0 μL 5×FastPfu緩沖液，2.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL引物(5 μmol/L)，0.4 μL FastPfu聚合酶，補ddH2O至20 μL；10 ng DNA模板。Illumina MiSeq測序，2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(美國Axygen Biosciences公司)進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。QuantiFluorTM-ST (美國Promega公司)進行定量檢測。根據Illumina MiSeq平臺標準操作規程將純化后的擴增片段構建PE300的文庫。構建文庫步驟:(1)連接“Y”字形接頭；(2)使用磁珠篩選去除接頭自連片段；(3)利用PCR擴增進行文庫模板的富集；(4)氫氧化鈉變性,產生單鏈DNA片段。采用美國Illumina Miseq PE300平臺進行測序。

1.3 生物信息分析

(1)生物信息分析的流程分析使用QIIME2推薦的DADA2方法，其插件對所有樣品的全部原始序列(input)進行質量控制(filtered)，去噪(糾正測序錯誤的序列,denoised)，拼接(merged),并且去嵌合體(non-chimeric)，形成OTU。OTU被稱為擴增特征序列(ASV)，以韋恩圖表示兩組特有或共有的OTU個數。將總OTU與數據庫比對，對物種在不同分類水平上進行注釋，以profiling 柱狀圖表示兩組物種的相對豐度。(2)LEfSe方法是非參數檢驗和線性判別分析的結合，適合菌群豐度差異檢驗；LEfSe尋找每一個分組的特征微生物(LDA大于閾值的微生物,閾值為2，每一橫向柱形體代表一個物種，柱形體的長度對應LDA值，LDA值越高則差異越大。柱形的顏色對應該物種是哪個分組的特征微生物，特征微生物表示在對應分組中的豐度相對較高)，也就是相對于其他分組，在這個組中豐度較高的微生物組成。(3)α多樣性分析是基于OTU分析結果，可反映菌群豐度和多樣性，包括chaol、observed-outs、shannon、simpson、ace和faith-pd等指數來評估某個樣本的物種多樣性，指數越高，表明樣本的多樣性越復雜。其中shannon用于估算樣本微生物多樣性，它的計算考慮到樣品中的分類總數和每個分類所占的比例，在得到整體的Alpha多樣性指數之后用非參數Kruskal Wallis檢驗方法比較其在各個樣品分組之間是否有顯著性差異。(4)β多樣性分析是對不同樣品間的微生物群落構成進行比較。對每個樣品的OTU信息構建了未加權的Unifrac距離矩陣(unweightedUnifrac distance matrix)。基于這一矩陣進行主成分分析，點與點之間的距離表示樣本菌群差異程度，兩點之間的距離越近，表明兩個樣本之間的微生物群落結構相似度越高，差異越小。在得到整體的Beta多樣性指數之后，接下來結合分組信息運用非參數多元方差分析(PERMANOVA)比較在各個樣品分組之間的微生物組成結構是否有顯著性差異。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 OTU和豐度分析

在數據按照barcode拆分之后每個樣品的實際序列為1 540 848條序列，平均每個樣品為55 030條。對照組大鼠OTU為890條，A、B組分別為1 289、1 126條，見圖1。根據物種注釋結果，各樣本物種在門、屬水平分類中組成柱狀圖，可見各樣本豐度較高的物種及其比例(圖2、3)。門水平:CIH組大鼠共有的優勢菌門且豐度從高到低依次為厚壁菌門(Firmicutes)70%、擬桿菌門(Bacteroidetes)22%、螺旋體門(Spirochaetes)3%、放線菌門(Actinobacteria)3%、變形菌門(Proteobacteria)1.2%、TM7 1.2%，對照組大鼠共有的優勢菌門且豐度從高到低依次為厚壁菌門(Firmicutes)73%、擬桿菌門(Bacteroidetes)25%、螺旋體門(Spirochaetes)0.1%、放線菌門(Actinobacteria)0.5%、變形菌門(Proteobacteria)0.6%、TM7 0.2%。屬水平：CIH組大鼠共有的優勢菌群豐度從高到低依次為乳酸菌(Lactobacillus)25%、Unspecified_S24_7 10%、未指明的梭菌目(Unspecified_Clostridiales)10%、未指明的毛螺菌科(Unspecified_Lachnospiraceae)6%、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)5%、未指明的瘤胃球菌科(Unspecified_Ruminococcaceae)4%、未指明的消化鏈球菌科(Unspecified_Peptostreptococcaceae)4%、普雷沃菌屬(Prevotella)4%、普氏菌-1(Prevotella_1)3%、顫螺旋體菌屬(Oscillospira)3%、未指明的梭菌科(Unspecified_Clostridiaceae)3%、密螺旋體屬(Treponema)3%、擬桿菌屬(Bacteroides)2%、蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)2%、糞球菌屬(Coprococcus)1%、未指明的F16(Unspecified_F16)1%、蜚蠊目(Blautia)1%、Dorea 1%，對照組大鼠共有的優勢菌群豐度從高到低依次為乳酸菌(Lactobacillus)46%、Unspecified_S24_7 12%、普雷沃菌屬(Prevotella)8%、未指明的梭菌目(Unspecified_Clostridiales)6%、未指明的毛螺菌科(Unspecified_Lachnospiraceae)4%、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)3%、未指明的瘤胃球菌科(Unspecified_Ruminococcaceae)3%、未指明的消化鏈球菌科(Unspecified_Peptostreptococcaceae)3%、普氏菌-1(Prevotella_1)3%、顫螺旋體菌屬(Oscillospira)2%、未指明的梭菌科(Unspecified_Clostridiaceae)2%、未指明的擬桿菌屬(Unspecified_Bacteroidales)1%。

2.2 OTU差異性分析

門水平LEfSe差異分析：在CIH組起主要作用的微生物群為螺旋體門(Spirochaetes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)，見圖4。CIH組大鼠腸道菌群豐度較高的有梭菌目、瘤胃球菌科、螺旋體綱、螺旋體門、螺旋體目、密螺旋體屬、毛螺菌科等；對照組大鼠腸道菌群豐度較高的有乳酸桿菌科、乳桿菌屬、乳桿菌目、桿菌綱、普雷沃氏菌屬等，兩組屬水平腸道菌群有顯著差異，見圖5。隨著低氧時間延長，腸道菌群多樣性越大，見圖6～8。

圖1 各組大鼠OTU韋恩圖

A1～A10:A組；B1～B8：B組；C1～C10：對照組。

A1～A10:A組；B1～B8：B組；C1～C10：對照組。

2.3 α多樣性分析

對照組大鼠shannon指數與simpson指數與A組、B組比較差異有統計學意義(P<0.05)，且隨著低氧時間延長，差異越大。A組和B組大鼠shannon指數差異無統計學意義(P>0.05)，圖9～11，表1、2。

圖4 門水平LEfSe分析LDA柱形圖

圖5 CHI組和對照組屬水平LEfSe分析LDA柱形圖

圖6 A組和對照組屬水平LEfSe分析LDA柱形圖

圖7 B組和對照組屬水平 LEfSe分析LDA柱形圖

圖8 A組和B組屬水平 LEfSe分析LDA柱形圖

圖9 A組和對照組shannon指數的箱型圖

圖10 A組和B組shannon指數的箱型圖

圖11 B組和對照組shannon指數的箱型圖

表1 各組大鼠腸道微生物群落α多樣性分析

表2 兩組大鼠各指數比較

2.4 β多樣性分析

對照組與CIH組主成分分析顯示，前兩個主成分分別解釋了總變量的32.8%和9.4%，見圖12。在X軸的方向上兩組大鼠腸道菌群相距較遠，低氧造成菌群差異較大。各個樣品分組之間微生物菌群有顯著差異，見圖13。

圖12 兩組腸道菌群的主成分分析

A：CIH組對對照組箱型圖；B：對照組對CIH組箱型圖。

3 討 論

人體消化道中存在豐富的絨毛、微絨毛，微生物可以通過分泌黏液因子在其中定殖。人體腸道中有約100萬億個細菌，生理狀況下，各系統、器官的相互協調、腸道特有的屏障功能保護，細菌和各類有毒物質不會對機體產生傷害。如果這些屏障遭到破壞，微生態平衡被打破，細菌和各種毒素可穿過腸壁，侵入機體各個系統及器官，如淋巴結、血液、肝、脾等，即腸道菌群移位。人或動物的腸黏膜處于高灌注狀態，因此對缺血、缺氧十分敏感。機體整體或腸道缺血、缺氧的狀態會直接損傷腸道黏膜系統，導致腸道微生物菌群發生改變、菌群移位[6-8]。CIH是OSAHS的一種低氧模式，機體反復發生低氧、復氧過程中，可能引起類似缺血-再灌注的病理生理改變，產生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，進一步激活炎性反應，引起全身性效應。筆者通過腸道菌群高通量測序發現對照組大鼠腸道菌群結構與CIH組有顯著差異。屬水平CIH組大鼠腸道菌群豐度較高的有梭菌目、瘤胃球菌科、螺旋體綱、螺旋體門、螺旋體目、密螺旋體屬、毛螺菌科等，對照組大鼠腸道菌群豐度較高的有乳酸桿菌科、乳桿菌屬、乳桿菌目、桿菌綱、普雷沃氏菌屬、普雷沃氏菌科等。從以上可看出，低氧條件下大鼠腸道菌群發生改變，有害細菌增殖，益生菌減少。CIH所致腸道菌群改變類似于現代“肺-腸”軸理論的變化，它是肺部與腸道的雙向連接，故肺部發生疾病時，腸道微生物也會產生影響。就如同中醫有“肺病治腸、腸病治肺、肺腸同治”的觀念。腸道是人體微生物菌群最豐富的地方，雖然下呼吸道細菌少之又少但其菌群組成上與腸道相似。共同黏膜反應觀點指出機體在一個黏膜部位接收抗原遞呈細胞刺激后，細胞可以遷移至其他黏膜部位，腸道菌群的微生態可以從局部影響全身的免疫反應，從而影響肺黏膜[9]。微生物群與固有免疫系統的模式識別受體相互作用，調節炎性反應和固有免疫反應。其次腸道菌群代謝產生如乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽等短鏈脂肪酸，其可以通過激活核因子-κB信號通路影響免疫細胞遷移、激活、增殖和凋亡，從而發揮抗炎作用，誘導產生調節性T細胞，調節免疫功能，預防過敏性氣道炎癥的發生[10-11]。益生菌可以通過對免疫細胞發揮直接作用，促進健康的代謝物的釋放，進一步影響微生物群。THORBURN 等[12]實驗研究通過高纖維或乙酸鹽喂養小鼠，增加了肺組織中調節T細胞數量和功能，抑制過敏性氣道疾病。有實驗研究建立膿毒血癥老鼠模型，在實驗性膿毒癥結束后，通過細菌16S核糖體RNA編碼基因的測序發現肺群落以存活的腸道相關細菌為主，表明肺微生物群的腸-肺易位和改變可能是膿毒癥和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)發病的共同機制[13]。有關文獻報道將大鼠建立睡眠剝奪模型，分為模型組及對照組，結果顯示模型組腸道內產氣莢膜梭菌數量增加，而其他菌群數量如大腸桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌則呈現不同程度下降[14]。

有研究推斷毛螺菌在無菌受者中，毛螺菌株的定植，導致空腹血糖升高、肝臟和腸系膜脂肪組織重量增加、血漿胰島素水平降低等，從而推測毛螺菌促進細菌脂多糖移位從消化道進入血液[15]。有研究發現睡眠碎片化小鼠引起食物攝入增加和可逆的腸道微生物群變化，其特征是毛螺菌和瘤腎球菌的細菌成員優先生長，乳酸桿菌科減少，這些導致全身和內臟白色脂肪組織炎癥，進一步導致腸道上皮屏障破壞[16]。有關研究發現益生菌如乳酸桿菌能產生β-葡聚糖，使小腸黏膜上皮細胞表面的黏液更加黏稠，并且更能耐受外界各種有害物質及致病菌對腸道黏膜的損傷[17]。本實驗中通過OUT豐度分析發現，屬水平CIH組大鼠乳酸菌(25%)遠低于對照組(46%)。

Treg缺失介導的自身免疫性疾病模型小鼠的腸道菌群進行基因檢測，結果發現小鼠模型腸道菌群發生了嚴重的紊亂，根據腸道菌群和代謝組譜的變化，選擇羅伊氏乳酸桿菌和代謝產物肌苷處理Treg缺失小鼠，羅伊氏乳酸桿菌和肌苷通過激活腺苷受體A2AR抑制了Treg缺失引起的自身免疫性疾病[18]。隨著人們生活質量的提高，OSAHS確診率的提高，目前越來越多的研究證實OSAHS并不是孤立的疾病，其與機體代謝、免疫、心血管系統疾病、腸道菌群紊亂密切相關。因此，更深入認識“肺-腸”軸之間的相關性，將會是了解OSAHS整個過程中腸道菌群的變化規律的切入點，深入研究腸道菌群改變對機體的影響，通過調節腸道菌群紊亂進一步糾正慢性CIH癥狀，有望成為治療OSAHS及各種相關疾病的靶點。