異位妊娠診斷相關(guān)分子miR378d 靶基因預(yù)測(cè)及生物信息學(xué)分析

蔣學(xué)鋒，駱秀容，曹麗娟，賴(lài)紫玲，肖天慧，卓蓉，王中海

（華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院 婦產(chǎn)科，廣東 深圳 518052）

0 引言

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一種長(zhǎng)約20～22 bp的高度保守的非編碼RNA，通過(guò)與目的基因的3'UTR相結(jié)合，從而降解靶基因的mRNA或抑制靶基因蛋白的翻譯[1]。miRNA可以直接或者間接參與靶基因的調(diào)控，一種 miRNA可以同時(shí)調(diào)控多個(gè)靶基因的表達(dá)。miRNA在許多疾病中異常表達(dá)，其穩(wěn)定性和抗降解性使其成為診斷各種疾病的有效的生物標(biāo)志物[2]。異位妊娠（ectopic pregnancy，EP）約占所有妊娠的1%～2%，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦死亡的主要原因之一[3]，由于盆腔炎癥發(fā)病、宮內(nèi)侵入性手術(shù)的增加，異位妊娠發(fā)病率有升高的趨勢(shì)。由診斷延遲而導(dǎo)致的漏診、誤診嚴(yán)重時(shí)將危及患者生命。miR-378d最近被報(bào)道是一個(gè)很有潛力的早期診斷異位妊娠的生物標(biāo)記物[4]，但是目前對(duì)miR-378d的研究還很少。本研究通過(guò)生物信息學(xué)的方法，預(yù)測(cè)它可能的靶基因，并進(jìn)行基因的功能和相互作用進(jìn)行分析，為研究該分子在異位妊娠中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 研究方法

利用miRDB[5]數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)microRNA-134的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用Metascape[6]（http：//metascape.org）對(duì)預(yù)測(cè)到的靶基因進(jìn)行富集分析。Metascape綜合采用基因本體（GO）、京都基因與基因百科全書(shū)（KEGG）、反應(yīng)組學(xué)基因集（reactome gene sets）和經(jīng)典通路（canonical pathways）等富集分析工具，采用超幾何分布算法，收集P＜0.01，最小計(jì)數(shù)為3，富集因子＞1.5的項(xiàng)。

本研究以人類(lèi)基因組作為背景基因，p 值通過(guò)累積超幾何分布算法來(lái)計(jì)算，而q值使用Banjamini-Hochberg 算法進(jìn)行多重檢驗(yàn)。在對(duì)富集項(xiàng)進(jìn)行分層聚類(lèi)時(shí)，使用Kappa scores作為相似性度量，相似度大于0.3的子樹(shù)被方可認(rèn)為是一個(gè)群。選擇一個(gè)在聚類(lèi)分析中經(jīng)計(jì)算統(tǒng)計(jì)意義最顯著（p值最佳）的項(xiàng)來(lái)表示該群，分層聚類(lèi)的結(jié)果以網(wǎng)絡(luò)方式呈現(xiàn)，顯示不同靶基因在信號(hào)通路或生物過(guò)程之間的聯(lián)系。

Metascape通過(guò)BioGrid、InWeb_IM7、OmniPath數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白－蛋白相互作用富集分析，探索這些靶基因中蘊(yùn)含的蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用MCODE算法尋找網(wǎng)絡(luò)中的密集聯(lián)結(jié)的蛋白質(zhì)群，并對(duì)其生物功能進(jìn)行注釋。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)測(cè)miR-378d的靶基因。運(yùn)用miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-378d的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，共獲得符合條件的靶基因309個(gè)。預(yù)測(cè)得分靠前的10個(gè)基因見(jiàn)表1。

表1 得分排前10的miR-378d靶基因

2.2 miR-378d相關(guān)靶基因的基因本體（GO）聚類(lèi)分析。針對(duì)預(yù)測(cè)到的靶基因地進(jìn)行基因本體（GO，GEGENE ONTOLOGY）分析，提示miR-378d涉及多種生物學(xué)過(guò)程，如圖1所示，包括生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、多細(xì)胞器官的生長(zhǎng)等。通過(guò)圖2，可以清楚地顯示309個(gè)靶基因中，哪些功能相關(guān)的基因聚集在一起。miR-378d發(fā)揮作用的機(jī)制可能與這些生物過(guò)程或信號(hào)通路有關(guān)。

表2 與妊娠相關(guān)的靶基因

圖1 miR-378d相關(guān)靶基因的基因本體（GO）聚類(lèi)分析

圖2 功能相近的靶基因的富集分析

2.3 與妊娠相關(guān)的靶基因。靶基因中有多個(gè)基因涉及生殖結(jié)構(gòu)的發(fā)育、女性妊娠、胚胎植入和生殖過(guò)程的調(diào)節(jié)等與妊娠緊密相關(guān)的生物過(guò)程，見(jiàn)表2。

2.4 m i R-3 7 8 d 靶基因間相互作用分析。利用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-378d的靶基因進(jìn)行相互作用分析，見(jiàn)圖3。運(yùn)用MCODE算法尋找靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)中密集聯(lián)結(jié)的蛋白質(zhì)群。3統(tǒng)計(jì)意義最顯著的項(xiàng)被保留作為對(duì)應(yīng)群的功能描述，包括：SCF依賴(lài)的蛋白酶體泛素蛋白分解代謝過(guò)程、核酸剪切修復(fù)和類(lèi)泛素化修飾。miR-378d發(fā)揮調(diào)控作用可能與這些過(guò)程相關(guān)。

圖3 miR-378d靶基因間相互作用圖

3 討論

miRNA不編碼蛋白質(zhì)而重點(diǎn)參與轉(zhuǎn)錄后靶基因的調(diào)控，在細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、發(fā)育、代謝以及凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，micro RNA在血液及體液中能穩(wěn)定表達(dá)，便于檢測(cè)，外泌體microRNA包裹在外泌體中進(jìn)行運(yùn)輸，更加穩(wěn)定，因而近來(lái)成為許多疾病無(wú)創(chuàng)早期診斷研究的熱點(diǎn)。這方面的大量研究集中于惡性腫瘤或者心血管疾病等方面[7]，近期近年來(lái)，妊娠相關(guān)循環(huán)miRNA已被廣泛用作診斷妊娠相關(guān)并發(fā)癥的潛在血清學(xué)指標(biāo)，miRNA血漿濃度的變化可以反映妊娠的特殊病理狀態(tài)，如先兆子癇、早產(chǎn)和胎兒生長(zhǎng)缺陷、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病等[8]。

異位妊娠是婦科常見(jiàn)的急腹癥之一，對(duì)于典型的異位妊娠患者，目前診斷和治療的手段都很成熟，但對(duì)于停經(jīng)時(shí)間短、無(wú)癥狀或癥狀不典型的患者，仍容易發(fā)生漏診和誤診。所以，臨床上需要開(kāi)發(fā)新的、更加靈敏和特異的異位妊娠早期診斷生物標(biāo)記物。國(guó)內(nèi)外，目前關(guān)于miRNA 分子在異位妊娠早期診斷中應(yīng)用的研究尚不多，僅有幾項(xiàng)，包括：miR-323-3p[9-12]、miR-873[10-12]，miR-520a[11]等，據(jù)報(bào)道它們都具有較好的靈敏度和特異性，但目前均尚未進(jìn)入臨床使用。外泌體miR-378d最近被報(bào)道在異位妊娠患者中的濃度顯著高于正常宮內(nèi)妊娠組和自然流產(chǎn)組，作為單一標(biāo)記物具有較高的靈敏度和特異性，是異位妊娠早期診斷很有潛力的生物標(biāo)志物。

目前對(duì)miR-378d的研究不多，miR-378微小RNA家族成員眾多，目前主要集中在多種惡性腫瘤的診斷如腸癌、肺癌、乳腺癌等，以及肝纖維化、結(jié)核分枝桿菌的清除等研究中。其發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的靶基因、作用機(jī)制等尚不十分明確。本研究采取生物信息學(xué)方法，預(yù)測(cè)miR-378d的靶基因，并對(duì)他們涉及的生物過(guò)程、信號(hào)通路等進(jìn)行聚類(lèi)分析，對(duì)靶基因間的相互作用關(guān)系進(jìn)行分析。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)miR-378d涉及多種生物學(xué)過(guò)程，包括生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、多細(xì)胞器官的生長(zhǎng)、細(xì)胞代謝過(guò)程的正向調(diào)節(jié)等，其中與女性妊娠的基因FANCA、TAF4、ZFPM2、PLEKHA1、ARID5B，胚胎植入相關(guān)的基因H3-3A、H3-3B、PRL、ACOD1等可能參與miR-378d在異位妊娠中的作用中來(lái)。通過(guò)靶基因相互作用分析發(fā)現(xiàn)，涉及肽和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)、蛋白定位的建立、SCF依賴(lài)的蛋白酶體泛素化蛋白分解代謝過(guò)程、核酸剪切修復(fù)和類(lèi)泛素化修飾的那些靶基因，相互作用聯(lián)系得比較緊密。綜上所述，目前對(duì)miR-378d如何在異位妊娠中發(fā)揮作用尚不清楚，確切的靶基因或作用機(jī)制涉及哪些具體的生物過(guò)程，均需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，但本研究為以后的研究提供了一定的參考。