四種石斛花化學成分及抗氧化活性

李崇萍， 劉倩葶， 劉琨毅,3， 梁正維， 劉明麗， 張正艷， 程建勝，趙菊潤， 安江珊， 李紅葉， 張新鳳， 趙 明*

(1.云南農業大學龍潤普洱茶學院， 昆明 650201； 2.云南農業大學云南省藥用植物生物學重點實驗室/西南中藥材種質創新與利用國家地方聯合工程研究中心， 昆明 650201； 3.云南農業大學食品科學技術學院， 昆明 650201； 4.云南品斛堂生物科技有限公司， 德宏 678300； 5.龍陵縣石斛研究所， 德宏 678300； 6.浙江農林大學省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室， 杭州 311300)

石斛屬(DendrobiumSw.)為蘭科(Orchidaceae)植物中的第二大屬，廣泛分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區[1]。在全世界有1 400多種，目前中國已記載石斛屬植物81種，2變種，其中18種為中國特有種[1]。中醫認為，石斛具有滋陰清熱、生津益胃、潤肺止咳、明目強身等功效；現代藥理研究認為石斛具有增強免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降血壓等功效[2-3]。《中國藥典》(2020版)收載鐵皮石斛與石斛兩個藥材，前者指鐵皮石斛(D.officinaleKimura et Migo)的莖，是傳統名貴藥材[4]；后者包括金釵石斛(D.nobile Lindl)、鼓槌石斛(D.chrysotoxumLindl.)或流蘇石斛(D. fimbriatum Hook.)及其同屬植物近似種的新鮮或干燥莖[5]。紫皮石斛(D.devonianumPaxt)是一種多糖含量較高，集藥用、保健、食用和觀賞為一體的石斛[6]。梳唇石斛(D.strongylanthumRchb. f.)主要分布于云南景洪、勐海，是中國一級珍稀瀕危藥用石斛原植物之一[7-9]。

隨著組培技術的發展，石斛已經廣泛被人工種植。目前大面積種植的石斛，主要是鐵皮石斛、霍山石斛、紫皮石斛，除此之外鼓槌石斛及梳唇石斛也有部分種植。云南是中國石斛種植面積最大的省份，其種植面積多達8萬畝(1畝=666.67 m2)，全國70%的石斛出自云南[10]。截止到2018年，全國鐵皮石斛種植面積達8萬余畝，其中云南鐵皮石斛種植面積已達5萬畝，占全國鐵皮石斛種植面積的49.7%[11]。云南省龍陵縣是“紫皮石斛之鄉”，2018年，全縣紫皮石斛種植面積2.02萬畝，占全國種植和產量的70%以上[12]，云南鼓槌石斛人工栽培面積達已達1萬畝，年產鮮花1 198.21 t，實現產值2 396.4萬元；產鮮莖13 309.7 t，實現產值15 962.4萬元[13]。在石斛種植過程，產生了大量的石斛花，不僅具有觀賞價值，而且具有重要的開發價值。2018年6月，中華人民共和國國家衛生健康委員會衛健委發布通告鐵皮石斛花作為新食品原料終止審查，按照地方特色食品進行管理[14]。2020年6月，浙江省衛生健康委員會發布關于《浙江省食品安全地方標準 干制鐵皮石斛花》(DB33/ 3011—2020)的通告[15]。2020年6月，廣西壯族自治區衛生健康委員會發布《鐵皮石斛花》(DBS45/ 062—2019)食品安全地方標準[16]。2020年7月，福建省衛生健康委員會關于發布《福建省食品安全地方標準 鐵皮石斛花》(DBS35/ 001—2020)的通告[17]。2020年7月，貴州省衛生健康委員會發布《食品安全地方標準鐵皮石斛花(干葉)》(DBS52/ 045—2020)[18]。2018年2月，《云南省食品安全地方標準 紫皮石斛》(DBS 53/027—2018)開始實施[19]。由此可見，更多石斛花的品種即將納入食品管理行列，其物質組成、生物活性以及產品開發利用將成為一個新的研究熱點。

關于石斛花的化學成分與生物活性，已經有部分報道，如：李芳等[20]研究發現鐵皮石斛花具有良好的抗氧化活性；呂素華等[21]研究表明鐵皮石斛花中含有較為豐富的多糖、浸出物及氨基酸等營養成分；雷珊珊等[22]研究表明鐵皮石斛花能改善陰虛、改善肝功能損傷；楊曉娜等[23]研究表明紫皮石斛花色苷色素具有良好的抑菌及自由基清除能力；Deng等[24]認為紫皮石斛花莖中含有大量具有免疫調節活性的多糖類物質；鼓槌石斛花中含有的菲類、聯芐類、芴酮類、酯類、甾體、維生素等物質，故其具有抗腫瘤活性、抗HIV活性、抗氧化活性和滋陰作用[25]，石斛花含有多糖、氨基酸、類黃酮、甾體、維生素等物質，具有抗氧化等、滋陰、免疫調節等活性。并且不同種類的石斛花外觀與物質組成，乃至生物活性都不同，有必要比較研究。

鐵皮、紫皮與鼓槌石斛在云南已經大面積種植，隨之也產生了大量的石斛花。梳唇石斛在云南零星種植，也有一定量的石斛花。隨著栽培面積的逐年擴大，產生了大量的石斛花，亟須對其產品進行深度研發，以促進云南石斛產業的良性發展。生物醫藥成為云南醫藥產業最具活力，最具成長性的產業，且未來前景樂觀[26-27]。研究4種石斛花的物質組成與生物活性，不僅具有重要的經濟價值，也具有一定的科學意義。為此，現以鐵皮石斛花、紫皮石斛花、鼓槌石斛花與梳唇石斛花為材料，測定比較化學成分及抗氧化活性，旨在為不同種類石斛花的開發和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

鐵皮石斛花(D.officinaleKimura et Migo’s flower，DOF)、紫皮石斛花(D.devonianumPaxt’s flower， DDF)、鼓槌石斛花(D.chrysotoxumLindl’s flower，DCF)、梳唇石斛花(D.strongylanthumRchb. f. ’s flower， DSF)于2018年5月采自云南品斛堂生物科技有限公司云南龍陵石斛種植基地(圖1)，采摘后40 ℃烘干，粉碎后過40目，待用。總抗氧化(total anti-oxidation competence，T-AOC)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基和羥自由基(·OH)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。楊梅素(myricetin, My)、槲皮素(quercetin，Qu)、木犀草素(luteolin，Lu)、山奈酚(kaempfero，Kf)、花旗松素(taxifolin，Tax)和蘆丁(rutin，Ru)標準品均購自天津一方科技有限公司；天冬氨酸(aspartic acid，Asp)、谷氨酸(glutamic acid，Glu)、絲氨酸(serine，Ser)、組氨酸(histidine，His)、甘氨酸(glycine，Gly)、蘇氨酸(L-threonine，Thr)、精氨酸(L-arginine，Arg)、丙氨酸(alanine，Ala)、酪氨酸(tyrosine，Tyr)、半胱氨酸[L(+)-cysteine，Cys]、甲硫氨酸(methionine，Met)、苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)、異亮氨酸(isoleucine，Ile)、亮氨酸(leucine，Leu)、賴氨酸(lysine，Lys)、纈氨酸(valine，Val)、脯氨酸(proline，Pro)標準品購自美國Agilent公司；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)均購于美國Sigma公司；其余試劑均為國產分析純。

圖1 4種石斛花樣品Fig.1 Four kinds of Dendrobium’s flower

1.2 儀器與設備

CP214型電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；HB10型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠； SHB-III型循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；HH-S28S型數顯恒溫水浴鍋，金壇市大地自動化儀器廠；756CRT 型紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；1200型高速液相色譜系統，美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 理化指標測定

應用酒石酸亞鐵比色法[28]、茚三酮比色法[28]、苯酚-硫酸法[28]和蒽酮比色法[28]分別測定4種石斛花的多酚(polyphenols，PP)、游離氨基酸(free amino acid，FAA)、多糖(polysaccharide，PS)和可溶性糖(soluble sugar，SS)含量。

1.3.2 功能性成分測定

按照實驗室前期建立的方法，應用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測定氨基酸組分(Ala、Arg、Asp、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Tyr、Val)，并根據峰面積使用外標法進行定量分析[29]。應用實驗室前期建立的HPLC方法測定類黃酮物質(My、Qu、Lu、Kf、Tax、Ru)，并根據峰面積使用外標法進行定量分析[30]。

1.3.3 抗氧化活性測定

4種石斛花待測液的制備：在10 g石斛花粉末加入150 mL的50%乙醇，浸提48 h，經四層紗布過濾得到浸提液，-60 ℃凍干成粉末。用蒸餾水適當稀釋后分別按照T-AOC、DPPH·和·OH試劑盒要求進行T-AOC、DPPH·清除率與·OH清除率的測定。

1.4 數據分析

每個樣品提取3次，每次提取進行2次重復測定，以平均值±標準差表示。實驗數據用軟件SPSS statistics 22.0進行單因素方差分析，組間采用最小顯著差數法進行兩兩比較；利用軟件Origin 8.0進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 4種石斛花理化指標比較分析

4種石斛花中均檢測到PP、FAA、PS及SS(圖2)。PP含量為6.28%～14.58%，各石斛花之間差異顯著(P< 0.05)，其中，DOF中PP含量最高，DCF含量最低。FAA在DOF中的含量最高(2.37%±0.07%)，在DSF中次之(2.23%±0.11%)，在DDF中再次之(1.64%±0.05%)，在DCF中最低(0.94%±0.07%)，且相互之間差異顯著(P<0.05)。對機體免疫力具有增強作用的PS[2-3]在DOF中的含量最高(5.73%±0.04%)，在DCF中次之(4.82%±0.39%)。SS在DCF中含量最高(53.46%±0.68%)，在其余3種石斛花中無顯著性差異(P>0.05)。

不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 4種石斛花功能性成分比較分析

在4種石斛花中共檢測出24種功能性成分；除DSF沒有檢測到Val，其余3種石斛花均檢測到16種氨基酸，包括6種必需氨基酸(Ile、Leu、Met、Val、Phe、Thr)；除DDF沒有檢測到Tax，DCF沒有檢測到Ru、Lu，其余兩種石斛花均檢測到6種類黃酮物質(My、Qu、Lu、Kf、Tax、Ru)，如表1所示。

由表1可知，DSF的氨基酸總含量最高[(8.95±0.78)mg/g]，其次是DDF的氨基酸含量[(6.58±0.36)mg/g]，再次是DOF的氨基酸含量[(4.93±0.31)mg/g]，DCF的氨基酸總含量最低[(3.07±0.19)mg/g]，且4種石斛花氨基酸總含量之間存在顯著性差異(P<0.05)。其中，Arg、Asp、Cys、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Thr、Tyr12種氨基酸的含量在DSF中最高，Ala、His、Val3種氨基酸的含量在DDF中最高，Ser的含量在DOF中最高。類黃酮物質的總量在DDF中最高，達到了(5.87±1.41)mg/g；在DOF中其次，為(2.07±0.20)mg/g；在DSF中再次，為(1.01±0.41)mg/g；在DCF中最低，為(0.43±0.11)mg/g；4種石斛花類黃酮物質總含量相互之間存在顯著性差異(P<0.05)。其中，具有改善機體脂肪代謝、抑制甘油三酯積累功能的Qu[31]在DDF中含量最高，為(3.61±0.76)mg/g；具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化應激等生理功能的Tax[32]在DOF中含量最高，為(0.23±0.07)mg/g；用于心血管疾病等的治療與預防的Kf[33]在DDF中含量最高，為(1.51±0.30)mg/g；能改善由免疫應答引起的炎癥反應的My[34]在DDF中含量最高，為(0.65±0.29)mg/g；能有效消除自由基的Ru[35]在DSF中含量最高，為(0.61±0.17)mg/g；具有抗過敏、抗炎活性、降尿酸功能的Lu[35]在DDF中含量最高，為(0.06±0.01)mg/g。

表1 石斛花樣品功能性成分含量Table 1 Contents of functional components of Dendrobium’s flower

2.3 4種石斛花乙醇提取物抗氧化能力比較分析

氧化衰老是生物隨著時間推移自發的必然過程，延緩衰老是醫藥學家研究的重點[2-3]。4種石斛花乙醇提取物抗氧化活性測定結果如圖3所示。由圖3(a)可知，4種石斛花醇提物總抗氧化能力均隨著濃度增加而增強；濃度在1.5～4.0 mg/mL變化時，4種石斛花醇提物總抗氧化能力的高低順序均為：DSF>DOF>DDF>DCF，且在同一濃度條件下，4種石斛花醇提物的總抗氧化能力差異顯著(P<0.05)；當濃度在4.0 mg/mL時，DSF的總抗氧化能力最強，為(98.76±0.96)U。

自由基被認為是人體氧化衰老的主要因素，清除自由基的能力經常被作為抗氧化能力的評價指標[2-3]。由圖3(b)知，4種石斛花乙醇提取物濃度從0.15 mg/mL增加到0.45 mg/mL時，DDF對DPPH·清除能力均顯著高于另外3種石斛花(P<0.05)，其半抑制濃度(IC50)為0.054 1 mg/mL；DSF、DOF、DCF對DPPH·清除能力依次減弱，IC50分別為0.150 4、0.252 6、0.468 1 mg/mL。由圖3(c)知，4種石斛花乙醇提取物濃度從0.40 mg/mL增加到1.00 mg/mL時，DDF對·OH清除能力均顯著高于另外3種石斛花(P<0.05)，其IC50為0.509 2 mg/mL；DCF、DSF、DOF對DPPH·清除能力依次減弱，IC50分別為0.552 6、0.596 2、0.712 1 mg/mL。綜上，DDF與DSF相對于DOF和DCF具有較強的抗氧化能力。

同一濃度不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.4 4種石斛花化學成分與抗氧化活性相關性分析

研究表明多酚與類黃酮物質是石斛花的抗氧化活性成分[2-3]，但石斛花中含有多種化學成分，因此進一步分析了本研究檢測到的化學成分與抗氧化能力之間的相關性，其結果如圖4所示。結果表明，Ru、Asp、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Arg、Tyr、Cys、Met、Phe、Ile、Leu、PP、FAA均與總抗氧化能力呈正相關(P<0.01)，PS與總抗氧化能力呈負相關(P<0.01)；除Tax、Pro、PS與DPPH·清除能力相關性不顯著外，其余化學成分均與DPPH·清除能力呈正相關(P<0.05)；Glu、Gly、Thr、Ala、Arg、Tyr、Cys、Met、Phe、Ile、Leu均與·OH清除能力呈正相關(P<0.01)，Tax、Ser、PS均與·OH清除能力呈負相關(P<0.01)。由此可見，4種石斛花檢測到的化學成分除Tax、Pro、PS外，其他成分對石斛花的抗氧化活性均具有一定的貢獻。

圖4 化學成分含量與抗氧化活性相關性分析Fig.4 Correlation among levels of chemical components and antioxidant activities

3 討論

氨基酸是有機體細胞的基本組成成分，是生物體合成蛋白質的基本原料，在生物體的生長代謝過程中起著關鍵作用[36]。4種石斛花均含有人體所必需的6種氨基酸，且以DSF的含量最高。

自由基又稱為游離基，它是單質或化合物的均裂而產生的帶有未成對電子的原子或基團[37]。已有研究證明，自由基參與多種疾病的病理過程。自由基清除劑在清除機體自由基,保護機體免受氧化損害中起重要作用[38-39]。天然的自由基清除劑已成為醫學、藥學、食品科學等領域的研究熱點[40]。氧化衰老是生物隨著時間推移自發的必然過程，延緩衰老是醫藥學家的重點研究課題。自由基被認為是人體氧化衰老的主要因素，清除自由基的能力經常被作為抗氧化能力的評價指標。研究表明，鐵皮石斛黃酮類化學成分主要集中于鐵皮石斛花中[20]。通過對4種石斛花的抗氧化能力檢測和比較，4種石斛花對DPPH自由基、羥自由基均具有較好的清除能力。其中，以DDF對自由基的清除能力最強，與具有良好抗氧化活性的類黃酮物質的總量在DDF中最高的結論相一致。

2018年6月中華人民共和國國家衛生健康委員會發布通告將鐵皮石斛花新食品原料申請列入終止審查目錄，鐵皮石斛花相關產品開發利用進一步擴大，多個省份已經出臺相關食品安全標準。其他石斛花相關地方標準的制定也正在進行中。進行4種石斛花氨基酸檢測，為其余3種石斛花作為食品新原料開發提供一定的理論支持。可為后續開發提取石斛花氨基酸產品相關產品提供理論支持。以期隨著中國大健康產業的發展，石斛花能得到更加充分利用，石斛產業的經濟效益增加，石斛產業良性發展。綜上所述，4種石斛花的開發有利于解決石斛花資源利用不充分的問題，對石斛產業的良性發展有重要作用。

4 結論

測定了DOF、DOF、DCF、DSF4類石斛花的理化指標、功能性成分與抗氧化活性。結果表明，4種石斛花中PP、FAA、PS和SS的含量分別為6.28%～14.58%、0.94%～2.37%、1.47%～5.73%和46.85%～53.46%，其中，PP、FAA、PS在DOF中含量最高，SS在DCF中含量最高。DSF的氨基酸總含量最高，為(8.95±0.78)mg/g，且4種石斛花氨基酸總含量之間存在顯著性差異(P<0.05)。類黃酮物質的總量在DDF中最高(5.87±1.41) mg/g，且4種石斛花相互之間存在顯著性差異(P<0.05)。DSF的總抗氧化能力最強，DDF對DPPH·清除能力及·OH清除能力最強。此外，相關分析發現Ru、Asp、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Arg、Tyr、Cys、Met、Phe、Ile、Leu、PP、FAA與抗氧化活性正相關(P<0.01)。因此，試驗結果為今后石斛花相關的健康產品等研發奠定了一定的基礎。