一種檢測鹽霉素膠體金試紙條的研制及其應(yīng)用

黃寶兵

摘 要：本研究應(yīng)用鹽霉素單克隆抗體研制出一種能夠檢測動物源性食品中鹽霉素的膠體金免疫層析試紙條，檢測限為20μg/kg，檢測時間僅為15min，假陽性率和假陰性率均為0，符合《獸藥殘留檢測試劑盒（條、卡）備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》的要求。該試紙條能夠應(yīng)用于基層實驗室的大批量樣本檢測，具有實際意義，并且未見免疫方法相關(guān)文獻報道，具有創(chuàng)新性。

關(guān)鍵詞：鹽霉素? 膠體金免疫層析試紙條? 快速檢測

引言

鹽霉素屬于聚醚類抗生素，不僅常用于防治雞、豬等畜禽的球蟲病，還能作為豬等家畜的生長促進劑。為牟取更高收益，不良畜牧業(yè)主會過量使用鹽霉素，導(dǎo)致動物源性食品中的鹽霉素超標，進而影響人類健康。因此，檢測動物源性食品中的鹽霉素具有必要性。目前，檢測鹽霉素的方法主要有高效液相色譜柱后衍生化法、UPLC-MS/MS法、液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法等儀器方法[1-6]，但鮮有快速檢測方法。上述儀器檢測方法耗時較長，單臺儀器成本在百萬元以上，難以用于基礎(chǔ)實驗室的檢測工作。膠體金免疫層析試紙條屬于快速檢測方法，檢測時間小于30min，試紙條成本幾元至幾十元不等，非常適合基層實驗室的大批量檢測工作。本研究開發(fā)了一種檢測鹽霉素的膠體金免疫層析試紙條，其能夠檢測動物源性食品中的鹽霉素抗生素殘留，實際應(yīng)用價值較高。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鹽霉素、馬杜霉素、紅霉素、泰樂菌素、莫能菌素等標準品（純度≥95%），購自北京標準物質(zhì)研究中心;氯金酸（HAuCl4·3H2O），購自美國Sigma公司;檸檬酸三鈉，購自北京百欣試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 膠體金的制備

取0.01%氯金酸水溶液100mL加熱至沸騰;一邊攪拌，一邊準確加入1%檸檬酸三鈉溶液1.5mL;待氯金酸水溶液變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)煮沸15min，冷卻后于4℃避光保存[7-10]。

1.2.2 鹽霉素單克隆抗體-膠體金標記物的制備

在磁力攪拌下，用0.2mol/L Na2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至7.2，每毫升膠體金溶液中加入50μg鹽霉素單克隆抗體，混勻，靜置10min，加入10%BSA，使其在膠體金溶液中的體積百分含量為1%，靜置10min。然后離心、洗滌、重懸，置于4℃?zhèn)溆肹7-10]。

1.2.3 結(jié)合物釋放墊的制備

將結(jié)合物釋放墊浸泡于含有牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在緩沖液中的濃度為0.5%）、pH值7.2、0.5mol/L的磷酸鹽緩沖液中，均勻浸濕1h，37℃烘3h備用。用Isoflow點膜儀將制備好的鹽霉素單克隆抗體-膠體金標記物均勻噴涂在結(jié)合物釋放墊上，每1cm結(jié)合物釋放墊噴涂0.01mL鹽霉素單克隆抗體-膠體金標記物后，置于37℃環(huán)境中（濕度<20%）60min后取出，置于干燥環(huán)境（濕度<20%）中保存?zhèn)溆肹7-10]。

1.2.4 反應(yīng)膜的制備

將鹽霉素包被原包被到反應(yīng)膜上構(gòu)成檢測線，將羊抗鼠抗抗體包被在反應(yīng)膜上構(gòu)成質(zhì)控線[7-10]。

包被過程：用磷酸緩沖液將鹽霉素包被原稀釋至10mg/mL，用Isoflow點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測線（T線），包被量為0.8μL/cm;用0.01mol/L、pH值7.4的磷酸鹽緩沖液將羊抗鼠抗抗體稀釋到200μg/mL，用Isoflow點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線（C線），包被量為1.0μL/cm。將包被好的反應(yīng)膜置于37℃條件下干燥2h，備用[7-10]。

1.2.5 樣品吸收墊的制備

將樣品吸收墊置于含0.5%牛血清白蛋白（體積分數(shù)）、pH值7.2、0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液中浸泡2h，37℃烘2h，備用[7-10]。

1.2.6 檢測方法

用吸管吸取70μL待檢樣品溶液垂直滴加于加樣孔中，液體流動時開始計時，反應(yīng)5～10min，根據(jù)示意圖判定結(jié)果或通過膠體金分析儀讀取檢測結(jié)果，其它時間判讀無效[7-10]。

1.2.7 樣本檢測限

在空白雞肉、豬肉等動物源性食品樣本中分別添加鹽霉素標準品至質(zhì)量濃度為0、10、15、20、25、30μg/L，按照“1.2.6”所述方法用3批試紙條進行檢測，每個濃度重復(fù)5次，根據(jù)實驗結(jié)果確定樣本檢測限[9-10]。

1.2.8 試紙條的特異性

分別配制500μg/L的馬杜霉素、紅霉素、泰樂菌素、莫能菌素等藥物，用該試紙條檢測，重復(fù)3次，判斷試紙條的特異性。

1.2.9 試紙條的準確性

農(nóng)業(yè)部文件要求，以假陽性率和假陰性率表示膠體金免疫層析法的準確性。取經(jīng)儀器確證的50份陰性雞肉、豬肉等動物源性食品樣品（質(zhì)量濃度小于20μg/kg），50份陽性雞肉、豬肉等動物源性食品樣品（質(zhì)量濃度大于20μg/kg），然后用該試紙條進行鹽霉素藥物殘留檢測，計算假陽性率和假陰性率。《獸藥殘留檢測試劑盒（條、卡）備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》規(guī)定：試紙條假陽性率應(yīng)小于5%，假陰性率應(yīng)為零[9-10]。

1.2.10 試紙條的穩(wěn)定性

將試紙條保存于2～8℃環(huán)境中，每隔1個月檢測試紙條的準確性，連續(xù)測定15個月。具體方法為：分別檢測經(jīng)儀器確證的20份陰性雞肉、豬肉動物源性食品樣品（質(zhì)量濃度小于20μg/kg），20份陽性雞肉、豬肉動物源性食品樣品（質(zhì)量濃度大于20μg/kg），重復(fù)測定2次，然后根據(jù)實驗結(jié)果判定試紙條的穩(wěn)定性[9-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金的鑒定

肉眼觀察制備的膠體金，其顏色為酒紅色、均勻度較好、無雜質(zhì)、透明度較高。取冷卻后的膠體金溶液在透射電鏡下觀察膠體金顆粒的均一程度，并測量金顆粒粒徑。經(jīng)透射電鏡觀察，膠體金顆粒分布比較均勻，金顆粒的粒徑約為20nm[9-10]。

2.2 樣本檢測限

配置鹽霉素濃度分別為0、10、15、20、25、30μg/L的雞肉、豬肉動物源性食品樣品，按照“1.2.7”所述步驟進行檢測，確定檢測限。該試紙條的檢測限為20μg/kg，見表1、圖3、圖4。

2.3 特異性

使用試紙條檢測500μg/L的馬杜霉素、紅霉素、泰樂菌素、莫能菌素等藥物，結(jié)果均呈陰性，表明該試紙條特異性較好。

2.4 準確性

用試紙條檢測50份陰性動物源性食品樣品，檢測結(jié)果均為陰性，說明假陽性率低于5%;用試紙條檢測50份陽性動物源性食品樣品，試紙條檢測結(jié)果均為陽性，說明試紙條假陰性率為零，符合《獸藥殘留檢測試劑盒（條、卡）備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》的要求。

2.5 穩(wěn)定性

12個月內(nèi)，試紙條的假陽性率和假陰性率均符合要求，從第14個月起，試紙條會出現(xiàn)少量失效或假陽性等現(xiàn)象。

3 討論

目前，有關(guān)應(yīng)用快速檢測方法檢測鹽霉素的文獻非常有限，本文制備出一種商品化的膠體金免疫層析試紙條，并按照《獸藥殘留檢測試劑盒（條、卡）備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》的要求對試紙條進行了特異性、準確性、穩(wěn)定性等性能測試，均符合要求。該試紙條的檢測時間僅為15min，比現(xiàn)有文獻中的儀器方法用時更短，操作更簡便;檢測限為20μg/kg，且未見免疫方法相關(guān)文獻報道。

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