普通PCR與實時熒光PCR兩種方法研究鴨血中的鴨源性成分

范美霞 黃立強(qiáng) 徐傳霞 賈楠楠

摘 要：本研究采用普通PCR與實時熒光PCR兩種方法對山東省菏澤市市售鴨血中的鴨源性成分進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)兩種方法在檢驗結(jié)果上存在一致性。

關(guān)鍵詞：普通PCR? 實時熒光PCR? 鴨血? 鴨源性

鴨血富含蛋白質(zhì)和多種微量元素，這兩種特性使其具有補(bǔ)血與清熱解毒的作用，而且對預(yù)防和治療缺鐵性貧血癥具有較好的效果。雖然鴨血食用性較強(qiáng)，但在龐大的動物體系中，鴨子的血液量并不高，致使鴨血價格相對較高。正因如此，部分不法商家會在鴨血中摻雜豬血或其他動物血液來銷售以牟取利益。近年來，隨著對于動物源性基因組的研究逐漸增加[1]，以DNA為基礎(chǔ)的PCR技術(shù)在該領(lǐng)域日益盛行[2]。就動物血液而言，由于其保質(zhì)期短，故在加工制作的過程中會添加食用鹽和凝固劑[3]等化學(xué)物質(zhì)，加之在提取鴨血DNA過程中的物理作用等會對DNA造成破壞，最終導(dǎo)致DNA含量有所降解而使檢測結(jié)果存在偏差。目前，檢測鴨源性成分的方法主要有《食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第5部分：鴨成分檢測PCR法》（SN/T 3731.5-2013）[4]和《飼料中禽源性成分檢測方法 實時熒光PCR法》（SN/T 2727-2010）[5]，前者是普通PCR法，后者為實時熒光PCR法。相較而言，普通PCR靈敏度較低，實時熒光PCR靈敏度較高，但是對于一些特殊樣品需要將二者結(jié)合使用。本研究旨在通過兩種實驗方法的有機(jī)結(jié)合，以期為鴨血中鴨源性成分檢驗提供一定的實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

1.1.1 材料

鴨血，市售。

1.1.2 主要試劑

無水乙醇，天津市富宇精細(xì)化工有限公司;DNA提取試劑盒，天根生物公司;鴨源性檢測試劑盒，Takara公司。

1.2 主要儀器

Rotor Gene Q 熒光定量PCR儀，凱杰;普通PCR儀器。

1.3 樣品總DNA提取

鴨血的提取方法按照DNA提取試劑盒的相關(guān)說明進(jìn)行。

1.4 普通PCR反應(yīng)

按照SN/T 3731.5-2013[4]進(jìn)行。

1.5 實時熒光PCR反應(yīng)

1.5.1 反應(yīng)體系

預(yù)混液12.5μL、上下游引物各1μL、探針1μL、模板DNA 1μL，加超純水至25μL。

1.5.2 反應(yīng)條件

預(yù)變性95℃（10s），變性95℃（5s），退火延伸60℃，40個循環(huán)，根據(jù)擴(kuò)增曲線Ct值≤35為檢出鴨源性成分。

2 結(jié)果與分析

將所提取的鴨血DNA利用鴨源性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果見圖1。同時，對提取的鴨血DNA利用鴨源性引物進(jìn)行實時熒光PCR檢測，實驗結(jié)果見圖2。

由圖1可知，陰性對照和空白對照均無條帶產(chǎn)生，陽性對照在226bp處有條帶產(chǎn)生。該圖譜說明所提取的鴨血DNA在226bp處有可見條帶，檢出鴨源性成分。為確定鴨源性成分，故將所得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核酸測序，并與SN/T 3731.5附錄A中鴨線粒體細(xì)胞色素C氧化酶Ⅲ基因相對應(yīng)片段的序列對比，其片段大小正確，同源性達(dá)到98%，確證含有鴨源性成分。由圖2可知，實時熒光PCR檢測結(jié)果中，陰性對照和空白對照均未檢出，陽性對照正常，Ct值為19.53，兩個平行樣品Ct值分別為22.97與22.31，表明檢出鴨源性成分。同時表明，兩種檢驗方法具有一致性。

3 討論

本研究通過采用普通PCR與實時熒光PCR兩種方法對鴨血中的DNA樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，兩種方法的結(jié)果存在一致性。由此可見，兩種方法可以相互補(bǔ)充——普通PCR靈敏度低，可能對檢測結(jié)果造成誤判，故需要靈敏度高的實時熒光PCR法進(jìn)一步確認(rèn)結(jié)果的可靠性。另外，對于鴨血樣品來說，由于特殊的制作工藝會使其在制作過程中受到一些特殊因素的影響而造成核酸降解，影響檢測結(jié)果，進(jìn)而出現(xiàn)假陰性[6]。如徐慧等[7]在用普通PCR研究鴨血中鴨源性成分時，初次實驗，兩種方法均未檢出鴨源性成分，通過增加模板量，進(jìn)行二次擴(kuò)增才進(jìn)一步確定了該成分的存在。作為檢測機(jī)構(gòu)，必須將兩種方法結(jié)合起來對鴨血樣品進(jìn)行合理性、完善性檢驗，方可獲得可靠的數(shù)據(jù)，進(jìn)而出具一份確鑿的實驗報告。

參考文獻(xiàn)：

[1] 高丹丹，陳燕，王迎華等.動物肉制品基因組DNA的提取和純化[J].食品科技，2007（8）：42-44.

[2] 全國文獻(xiàn)工作標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會.《進(jìn)口動物源性飼料中牛羊源性成分檢測方法-PCR方法》（SN/T 1119-2002）[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2002.

[3] 邵碧英，楊婕，張體銀.動物產(chǎn)品的DNA提取方法[J].畜牧與獸醫(yī)，2005，37（9）：47-49.

[4] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.《食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第5部分：鴨成分檢測-PCR法》（SN/T 3731.5-2013）[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013.

[5] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.《飼料中禽源性的鑒定方法實時熒光PCR法》（SN/T 2727-2010）[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

[6] 呂二盼，周正等.動物源性食品鴨血、豬血DNA提取及多重PCR研究[J].食品工業(yè)科技：201233（6）：228-231.

[7] 徐慧，馬慧娟，動物源性食品鴨血中鴨成分普通PCR檢測方法研究[J].《食品安全導(dǎo)刊》2018.3：60-61.