雌性羅氏鼢鼠腸道微生物群落與功能預測的初步分析

陳曉寧 封 托 侯 祥 安曉雷 王 京 常 罡

(陜西省動物研究所，西安，710032)

羅氏鼢鼠(Myospalaxrothschildi)主要生存在我國西北地區，其環境適應性較強，嚴重損害農林牧的水土保持[1]。調查顯示，成年羅氏鼢鼠的身長通常為150—215 mm，體重為114—365 g。體型較其他鼢鼠偏小。四肢短而粗壯，有尖銳的爪子。前腳爪更發達，像鐮刀一樣向外彎曲。羅氏鼢鼠每天進食時間較長，不冬眠，常年在地下挖洞尋找食物。羅氏鼢鼠主要傷害幼樹，吃掉幼樹的根，引起禿頂并導致死亡[2]。

在中國天然藥庫的陜西省鎮巴縣，鼢鼠危害問題逐年加劇。該地區主要害鼠為羅氏鼢鼠[3]。例如根據作者的調查，在鎮巴縣內涇洋鎮的建邑種植場，每年約50%的藥材植株被羅氏鼢鼠損壞，對當地脫貧致富工作造成了影響。因此，有必要研究當地羅氏鼢鼠與特殊環境因素的相互關系。

腸道內容物的微生物種群結構與嚙齒類動物種類有密切關系，可以反映出環境對嚙齒動物的相互作用，確認其在生態系統中的位置，對于鼠害防控具有重要指導意義[4]。嚙齒動物腸道內容物中的微生物的種類功能與宿主的生理狀態組成動態平衡系統，與宿主的新陳代謝也有緊密聯系。有研究顯示，嚙齒類動物的不同腸道段內微生物在門水平上以分解利用植物的種類為優勢種群(厚壁菌門Firmicutes 和擬桿菌門Bacteroidetes)，占比達89%。十二指腸與其他腸道的微生物比例差異較大，而盲腸中厚壁菌門更多[5]。腸道微生物可以幫助嚙齒類動物應對植物次生代謝物的有毒成分，通過研究沙漠林鼠(Neotomalepida)腸道微生物的穩態，發現腸道微生物能協助宿主適應植物性食物中的有毒成分，拓展了宿主的飲食生態位。對小林姬鼠(Apodemussylvaticus)腸道微生物16S RNA測序分析，發現隨著季節變化，乳桿菌屬(Lactobacillus)微生物比例下降，另枝菌屬(Alistipes)，螺桿菌屬(Helicobacter)比例升高，相應的宿主食物由蟲子轉變為植物種子[6]。分析高原鼠兔的腸道內容物發現微生物組成越復雜，微生物系統穩定性越好[7]。一方面，優勢種群的腸道細菌會影響宿主的很多生理反應[8]；另一方面，宿主的物種屬性、生存狀態、食物組成和胃腸道生理結構反過來會調節腸道微生物的群落和組成。這種關系對宿主很重要[9-10]。晝夜的變化也會對嚙齒類動物腸道微生物數量造成影響，大多數白天處于休眠狀態，腸道乳桿菌含量較高，有利于胃腸蠕動，機體解毒，感知環境。而在夜間，厚壁菌和擬桿菌數量增加，能量代謝與細胞生長發育水平增強。對特定光暗循環期間收集的小鼠糞便進行宏基因組測序發現，某些腸道基因組數量差異較大，表明存在特定時間段微生物功能群[11]。有研究顯示，小型哺乳類動物的腸道菌群通過調節宿主的能量代謝來影響宿主的社會性行為[12]，有可能通過調控腸道微生物多樣性來影響嚙齒類動物的覓食與繁殖行為。嚙齒動物的性別與飲食結構差異也會影響到腸道微生物多樣性，雌性鼢鼠的腸道微生物群落組成很接近，而雄性鼢鼠的腸道微生物多樣性比較復雜[5]。近年來，使用不育餌料對鼠害控制取得一定進展[13]。研究羅氏鼢鼠腸道微生物的多樣性，可能幫助我們進一步理解羅氏鼢鼠與特定環境適應的機制。

現有研究多利用微生物分離與培養、克隆文庫構建等分子生物學方法探索腸道細菌多樣性[14-16]。但是，這些方法也有一定缺陷，可能會遺漏某些腸道微生物的種類。腸道內容的微生物本身就具有復雜的多樣性，而且有些菌種還依賴厭氧環境。隨著檢測技術的迅速發展，為了克服傳統針對微生物鑒定與分析方法的缺點，新一代的高通量測序技術廣受關注和利用[17]，由于腸道微生物基因結構的特點非常適合該技術的使用，尤其是高通量測序技術促進了腸道內容物中微生物多樣性分析的深度和廣度。研究羅氏鼢鼠腸道微生物菌群結構和功能，對鼠害防治將有重要參考價值。

本研究針對陜西省鎮巴縣中草藥種植區的羅氏鼢鼠樣品，采用Illumina高通量測序技術，分析雌性羅氏鼢鼠腸道細菌多樣性，探究該地區羅氏鼢鼠腸道細菌對宿主食物資源的參與模式，并對菌群對宿主代謝功能的關系進行預測，以期為防治羅氏鼢鼠提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品的采集與保存

3只羅氏鼢鼠活體捕捉自陜西鎮巴縣大池鎮(海拔：823 m；地理位置：32°23′N，107°36′E；年均氣溫：13.8℃)，性別均為成年雌性，體重為(172.22±17.91)g(mean±SD)。在野外臨時實驗室內，將活體樣本經過戊巴比妥鈉(質量濃度1%)麻醉，在無菌環境下實施解剖，解剖羅氏鼢鼠的盲腸，收集內容物，用滅菌凍存管保存待用，利用液氮罐帶回實驗室，凍存于-80℃冰箱備用。

1.2 腸道微生物 DNA 的提取

使用無菌藥勺在超凈工作臺里從收集的每個羅氏鼢鼠的盲腸內容物凍存管里取100—150 mg樣本，用干冰快遞送至華大基因公司做DNA的提取與分析。DNA提取基本流程是加液氮研磨，DNA試劑盒提取細菌總DNA(QIAGEN，德國)[18]。提取的DNA利用NanoDrop和瓊脂糖凝膠電泳進行質量檢測以及完整性檢測，合格的樣品進行測序。

使用TIANamp Stool DNA Kit(TIANGEN，China)對羅氏鼢鼠的盲腸內容物總基因組DNA進行提取，具體步驟見試劑盒說明書。使用通用引物338F-806R(338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCA GCAG-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAA T-3′)對16S rRNA基因V3-V4區進行擴增。20 μL反應體系如下：模板DNA 10 ng，5×FastPfu緩沖液4 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL，FastPfu聚合酶0.4 μL，BSA 0.2 μL，正反引物(5 μmol/L)均為0.8 μL，添加ddH2O補足反應體系。然后使用以下條件擴增DNA：95℃ 3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，循環25次；72℃ 10 min。在Illumina MiSeq平臺上對純化的PCR產物進行測序(華大基因)。

1.3 生物信息學分析

下機數據過濾，剩余高質量的clean data用于后期分析；通過reads之間的overlap關系將reads拼接成tags；將tags聚類成OTU并與數據庫比對、物種注釋；基于OTU和注釋結果進行樣品物種復雜度分析，組間物種差異分析，以及關聯分析與模型預測等[19]。α多樣性指數結果進行統計分析，即單因素方差分析和LSD分析。

使用PICRUSt軟件預測菌群的功能[20]。PICRUSt 軟件備份了greengene ID 對應的KO(KEEG Orthology，KEGG 直系同源)信息。PICRUSt 首先標準化OTU 豐度表，即去除16S 標記基因對樣品基因組中的拷貝數的影響。然后通過每個OTU對應的GreenGene ID，獲得OTU對應的KO，并通過KO對應的OTU豐度總和計算該KO的豐度。根據KEGG數據庫的信息和OTU豐度信息計算各功能類別的豐度。此外，針對Pathway，運用PICRUSt 分析代謝通路的信息，并分別得到豐度表。PICRUSt軟件備份了GreenGene ID 對應的 COG(clusters of orthologous groups of proteins，直系同源序列聚類)信息。因為不同種屬菌種的16S拷貝數不相同，PICRUSt首先標準化16S測序數據的種屬數量。然后，16S的種屬信息比對數據庫中的功能基因，產生預測結果。

2 結果與分析

2.1 腸道微生物多樣性

通過對羅氏鼢鼠腸道內容物樣品測序得到Tag數據量有50 000個。從α多樣性指數分析結果(圖1，Chao1指數)看出不同樣品的羅氏鼢鼠腸道內容物菌群多樣性有一定差異。對羅氏鼢鼠樣品α多樣性指數結果進行統計分析(表1)，Chao1指數和Ace指數在樣本1和2，及樣本1和3之間有顯著性差異，而樣本2和3之間無顯著性差異。顯示樣品1的腸道菌落多樣性要高于樣本2和樣本3。

表1 羅氏鼢鼠腸道樣品ɑ多樣性指數LSD分析表

2.2 分析羅氏鼢鼠的腸道菌群的物種組成

從圖2可以看出，OTUs稀釋曲線隨著測量深度的增加而趨于平坦，說明測量數據量比較合理。通過曲線的曲率判斷出測序的結果較為完整，所測的數據量可以包含腸道內容物所有微生物成分。但樣品3的測序深度可能不夠，多樣性指數曲線還在增長，還沒有到飽和期。樣品3的稀釋曲線相對另2個樣品斜率較大，可能是由于腸道樣品采取位置不同影響的，需要進一步調整測序方法，提高文庫覆蓋度。

OTU序列分類的結果(相似度設置為97%)顯示羅氏鼢鼠的腸道細菌隸屬10門9綱11目13屬。主要由放線菌門(Actinobacteria)(3.9%±4.2%)、變形菌門(Proteobacteria)(29.8%±37.9%)、擬桿菌門(31.4%±19.7%)、厚壁菌門(33.8%±15.3%)、柔膜菌門(Tenericutes)(0.06%±0.04%)、藍細菌門(Cyanobacteria)(0.007%±0.006%)、螺旋體菌門(Spirochaetes)(0.59%±0.65%)、迷蹤菌門(Elusimicrobia)(0.09%±0.13%)、候選門輻射類群(TM7)(0.39%±0.31%)和互養菌門(Synergistetes)(0.003%±0.004%)等組成。通過圖3的結果反映出，革蘭氏陰性菌的變形菌門和革蘭氏陽性菌的厚壁菌門的菌類在總體上(門級別)及擬桿菌門，是羅氏鼢鼠盲腸中的優勢菌群。從圖4可以看出，樣品3中埃希氏桿菌屬(Escherichia)以及梭桿菌屬(Clostridium)豐度較高，樣品1和2中革蘭氏陽性厭氧的瘤胃球菌屬(Ruminococcus)和顫螺旋菌屬(Oscillospira)是次一級分類水平的優勢群落(屬級別)。樣品3微生物豐度與另外2個樣品有差別，可能是樣品收集位置差異的影響。對比盲腸，嚙齒類動物十二指腸內變形菌門的細菌豐度會增加，而厚壁菌門豐度相對較少[21]。圖5為腸道細菌豐度熱圖，3個樣品差別不大。羅氏鼢鼠腸道微環境內的微生物多樣性及豐度的差別有必要進作一步的研究。

2.3 功能預測

PICRUSt軟件廣泛用于功能基因研究，并將菌群多樣性與宿主代謝情況聯系起來。經過分析，羅氏鼢鼠腸道細菌的很多基因與代謝相關，并且發現有與聚酮類化合物和萜類化合物代謝相關的基因(圖6)。KEGG通路分析預測出很多基本代謝功能基因，主要涉及神經系統、免疫系統、循環系統、內分泌系統、萜類和聚酮類化合物的代謝、信號轉導、外源性生物降解與代謝、遺傳信息處理、核苷酸代謝、輔助因子和維生素的代謝等。利用COG數據庫比對功能分析表明，在羅氏鼢鼠腸道細菌基因功能涉及糖類、脂類、蛋白質代謝(圖7)。

在門分類水平上顯示，羅氏鼢鼠腸道優勢菌群主要幫助宿主分解利用植物源食物。羅氏鼢鼠腸道細菌多屬于厚壁菌門和調節腸道糖代謝的擬桿菌門。

3 討論

經分析發現，在門的水平，羅氏鼢鼠腸道細菌能夠分解利用植物類資源。主要有放線菌門、變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門等，顯示羅氏鼢鼠具有很強的植物源食物適應性。奇蹄目(Perissodactyla)的馬(Equus)和驢(Equus)腸道菌群與羅氏鼢鼠的相似[22]。厚壁菌門細菌有助于代謝腸道中的多糖，而擬桿菌門細菌能夠幫助宿主從難以消化的食物中獲得能量，并保持動物腸道的健康[23]。高脂肪飲食會顯著地改變雌性小鼠的腸道微生物多樣性，厚壁菌門及該菌門中Leptum菌種的相對豐富度均顯著下降，可能雌性激素和腸道微生物相互作用有關[24]。

有研究顯示，植物性食物中的纖維素以及半纖維素在動物胃腸道中依靠Firmicutes和Bacteroidetes幫助消化[25]。長江中下游的草食性白額雁(Anseralbifrons)腸道多樣性由放線菌構成、豆雁(Anserfabalis)腸道微生物主要是變形菌，鴻雁(Ansercygnoides)的腸道微生物種由厚壁菌門占主要組成，這些菌類幫助雁類獲取薹草屬(Carex)、禾本科(Gramineae)等草本植物里的能量[26]。在屬的水平上出現的瘤胃球菌屬(厚壁菌門)能幫助消化纖維素和半纖維素為主的植物食物資源，瘤胃球菌屬還有纖維素酶，具有溶解微晶纖維素的功能[27]。草食性動物腸道普遍含有顫螺旋菌屬，可以分解宿主體內的葡萄糖產生丁鹽酸參與代謝[28]。而羅氏鼢鼠的腸道內的Escherichia可能是參與宿主碳水化合物代謝[29]，這可能與在春節捕獲樣品有關，食物來源比冬季更多，造成羅氏鼢鼠腸道內埃希氏桿菌屬豐度增加[30]。宿主本身的年齡變化也會導致腸道結構改變，從而能影響腸道菌群的組成，在幼年期以兼性厭氧菌為主，例如優勢菌為擬桿菌、梭菌等。隨著年齡增加，好氧菌逐步轉變為厭氧菌，主要是擬桿菌豐度的持續增加。成年哺乳動物腸道微生物主要類群為厚壁菌門和擬桿菌門。老年動物腸道中的擬桿菌門和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)無論是數量還是多樣性都在下降，腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、鏈球菌科(Streptococcaceae)等細菌數量上升。宿主基因型會通過免疫系統影響腸道菌群的組成[31]。豬類的回腸黏膜菌群組成會受宿主基因型影響而改變[32]。上述結果展現出環境因素可能對羅氏鼢鼠腸道微生物多樣性有明顯的影響，詳細的機制仍需更多的研究。

利用PICRUSt可以研究腸道微生物-宿主-環境之間的關系[33]。借助與KEGG的比較搜索，該研究發現羅氏鼢鼠的腸道菌群編碼的大多數基因與代謝有關，其次是涉及遺傳和環境信息處理。通過預測找到了和萜類化合物以及聚酮類化合物代謝相關的通路(圖6)。作者調查發現鎮巴縣當地多種植黨參和黃芪，此類藥材中普遍含有萜類化合物[34-35]。真菌和植物共同作用可以合成聚酮類物質，具有藥用性能[36]。這顯示羅氏鼢鼠的腸道微生物可能參與調節宿主對中藥材類食物以及特殊環境的適應性。

COG功能分類統計表明，羅氏鼢鼠腸道細菌中參與糖類、脂類、蛋白質代謝的功能基因具有較高豐度，多屬于一些保守功能[37]。厚壁菌門的微生物具有降解纖維素的功能，幫助鼢鼠調節糖代謝[27]。擬桿菌門和變形菌門中很多微生物也會導致宿主患病而死亡，又可能間接影響鼢鼠的種群數量[38]。有報道顯示，鼢鼠的腸道微生物種類更接近哺乳動物[5]，因此有必要在搜集更多哺乳動物全基因組編碼蛋白質序列進行系統發育分析。本研究通過高通量分析腸道菌群的多樣性和菌株在宿主上的功能，對于探索羅氏鼢鼠對環境的適應性具有重要參考價值[39]，其他環境以及雄性遺傳因素對腸道菌群與羅氏鼢鼠的相互作用的影響有待進一步研究。

致謝：感謝鎮巴縣泰昌農牧有限公司朱艷琴、張生協助捕獲實驗鼠。