超聲輔助提取陜產天麻多糖的工藝優化及抗氧化活性研究

張雙奇，劉 琳，何念武，趙 穎

（1商洛學院生物醫藥與食品工程學院，陜西商洛726000；2丹鳳縣農業技術推廣中心，陜西商洛726000)

0 引言

天麻(Gastrodia elata Bl.)為蘭科天麻屬多年生草本植物，生長于海拔400～3200 m潮濕冷涼的沙質土壤林地，其塊莖可入藥且是中國的名貴中藥材[1-3]。天麻中的化學成分主要有酚類及其苷類、多糖類、有機酸類、甾醇類以及多種氨基酸和人體所需的微量元素等[4-5]。例如天麻素（對羥甲基苯甲醇-β-D-吡喃葡萄糖苷）、天麻多糖(GBP-Ⅰ、GBP-Ⅱ)[6]、天麻苷元（對羥基苯甲醇）、對羥基苯甲醛、巴利森苷C、巴利森苷A、腺苷、胡蘿卜苷、對羥芐基乙基醚、對羥芐基甲醚、β-谷甾醇、棕櫚酸、鄰苯二甲酸二甲酯等[7-8]。

目前的研究結果表明，天麻素和天麻多糖是天麻主要的有效成分，天麻素具有鎮靜催眠、保護腦部神經和減輕由興奮性氨基酸對神經系統引起的興奮性毒性作用[9-11]；天麻多糖具有抗氧化性，且可有效延緩骨骼肌衰老[12-13]。目前常用的天麻多糖提取方法主要有熱水浸提法、酶解法及回流醇沉法等，多糖的得率總體為9%～23%[14-15]，而當在提取過程中加入超聲波輔助后，天麻多糖得率可提高到30%[16-17]。

另外有研究結果表明，由于海拔、溫濕度、光照、土壤等自然條件的限制，不同產地天麻的有效活性成分、水分、粗脂肪、粗纖維等含量存在顯著差異[18-19]。陜西商洛地處中國中緯度偏南地帶，位于秦嶺南麓，分布在北亞熱帶和暖溫帶交界區域，平均海拔800～1200 m，土壤有效磷含量為中磷水平且富含有機質[20-21]，因此商洛也屬于高品質天麻的主產地之一。商洛天麻的水分、總灰分含量均低于《中國藥典》（2015年版）標準，天麻素和對羥基苯甲醇的含量則達到了標準的2.5倍以上[22]，但針對商洛天麻的理化特性而進行的研究非常少，故本文以商洛春麻為原材料，以超聲波輔助熱水浸提法對天麻多糖的提取工藝進行了優化，再進行天麻多糖的體外抗氧化活性的研究，以期為商洛當地天麻的深加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天麻，購于陜西商洛（經鑒定為蘭科天麻屬腐生草本植物）。DPPH（上海源葉生物科技有限公司）；抗壞血酸（北京索萊寶科技有限公司）；苯酚、乙醇、濃硫酸、三氯甲烷、葡萄糖、水楊酸鈉、亞硫酸亞鐵等均為分析純試劑。該試驗于2019年11月—2020年4月，在商洛學院生物醫藥與食品工程學院生物學實驗中心進行。

1.2 儀器與設備

超聲波清洗機（KH-300DE，北京中西遠大科技有限公司），紫外可見分光光度計（T2600，上海佑科儀器儀表有限公司），高速離心機（HC-3018，安徽中科中佳科學儀器有限公司），多功能粉碎機（ME204E，濟南安環醫療器械有限公司），旋轉蒸發儀（RE-301，上海況勝科技有限公司），電子分析天平（GL1004C，上海佑科儀器儀表有限公司）。

1.3 提取工藝優化方法

1.3.1 提取方法 本試驗在借鑒已有提取方法的基礎上，提出了超聲波輔助熱水浸提法，具體流程見圖1。

圖1 超聲波輔助熱水浸提流程

1.3.2 標準曲線的繪制 采用苯酚-硫酸法。分別吸取1 mg/mL的葡萄糖標準溶液1、2、3、4、5、6、7 mL定容至50 mL備用，分別量取1 mL上述容液于不同錐形瓶中，各加入1 mL濃度為5%的苯酚溶液和5 mL濃硫酸，40℃水浴20 min，在490 nm處測定吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.3 天麻多糖含量的測定 量取1.3.1節方法中制得的天麻粗多糖樣品，配制質量濃度為1 mg/mL的天麻粗多糖溶液，按照1.3.2節方法測定吸光度，按照公式(1)計算天麻多糖含量[23]。

其中P為天麻多糖含量(mg/g)，C為樣品溶液中天麻多糖質量濃度(μg/mL)，V為樣品定容體積(mL)，M為原料質量(g)。

1.3.4 單因素試驗 本試驗以料液比(1:25、1:30、1:35、1:40、1:45)、水提溫度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)、水提時間(25 min、30 min、35 min、40 min、45 min)作為主要影響因子，并在每個因素中篩選效果顯著的3個水平量，設計L9(34)正交試驗，分析得出超聲波輔助熱水浸提法提取天麻多糖的最優參數。

1.4 體外抗氧化活性測定方法

1.4.1 DPPH自由基清除能力的測定 取1 mL不同質量溶度的樣品(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL)分別放于試管1、2、3、4、5、6、7中，然后依次加入3 mL 0.004% DPPH-乙醇溶液，充分混勻，避光靜置20 min后，517 nm波長處測吸光度A，以乙醇代替樣品為空白對照測得吸光度A0，以無水乙醇代替DPPH-乙醇溶液測得吸光度A1，Vc作陽性對照，再按照公式(2)計算DPPH自由基清除率[24]。

其中D為DPPH自由基清除率，A為3 mL 0.004% DPPH-乙醇溶液+1 mL樣品溶液的OD值；A1為3 mL無水乙醇+1 mL樣品溶液的OD值；A0為3 mL無水乙醇+1 mL無水乙醇的OD值。

1.4.2 羥基自由基清除能力測定 利用Feton體系法測定，取1 mL不同質量溶度的樣品(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL)分別放于試管1、2、3、4、5、6、7中，依次加入10 mmol/L水楊酸鈉-乙醇溶液、10 mmol/L亞硫酸亞鐵溶液、8.8 mmol/L過氧化氫溶液各1 mL，充分混勻，于37℃下恒溫水浴30 min。反應結束后于510 nm處測定樣品吸光值A。以蒸餾水代替樣品溶液測得A0，以蒸餾水代替過氧化氫溶液測得A1，按照公式(3)計算羥基自由基清除率[25]。

其中E為羥基自由基清除率，A為1 mL樣品溶液+1 mL水楊酸鈉-乙醇溶液+1 mL亞硫酸亞鐵溶液+1 mL過氧化氫溶液；A1為1 mL樣品溶液+1 mL水楊酸鈉-乙醇溶液+1 mL亞硫酸亞鐵溶液+1 mL蒸餾水；A0為1 mL蒸餾水+1 mL水楊酸鈉-乙醇溶液+1 mL亞硫酸亞鐵溶液+1 mL過氧化氫溶液。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

按照1.3.2標準曲線的繪制方法，繪制葡萄糖標準曲線，標準曲線的線性回歸方程為：y=0.0094x-0.0232，R2=0.9973，結果見圖2。

圖2 葡萄糖標準曲線

2.2 單因素試驗

2.2.1 料液比對天麻多糖提取率的影響 料液比對天麻多糖提取率的影響結果見圖3。在提取溫度為60℃，提取時間為40 min時，提取率隨液料比的增大呈現出先增后減的趨勢，在料液比為1:40 g/mL多糖提取率達到峰值。可能是因為隨著溶劑的增大，天麻粉末與溶劑的接觸面積變大，導致可溶性多糖溶出比率升高，但當料液比超過1:40 g/mL后，溶液已達飽和，故溶出比率提升不明顯[26]，故初步確定料液比為1:40 g/mL。

圖3 料液比對多糖提取率的影響

2.2.2 水提溫度對天麻多糖提取率的影響 水提溫度對天麻多糖提取率的影響結果見圖4。在提取時間為35 min，料液比為1:40 g/mL的條件下，提取率隨溫度的增加而增加，但在溫度高于60℃后，提取率增加趨于平緩。隨著水提溫度的升高，多糖的溶解度逐步增大，但溫度過高可能會導致多糖的糖鏈斷裂，致使多糖難于回收[27]，故初步確定水提溫度為60℃。

圖4 提取溫度對多糖提取率的影響

2.2.3 水提時間對天麻多糖提取率的影響 水提時間對天麻多糖提取率的影響結果見圖5。在提取溫度為60℃，料液比為1:40 g/mL的條件下，提取率隨時間的增加而增加，但在提取時間大于40 min后，提取率增加效果不顯著。多糖長時間處于高溫提取環境下，可能會發生多糖的降解，造成多糖雜質較多[28]，故初步確定水提時間為40 min。

圖5 提取時間對多糖提取率的影響

2.3 正交試驗結果

2.3.1 因素與水平的確定 根據上述單因素試驗結果，篩選出料液比、提取溫度、提取時間3個影響超聲波輔助熱水浸提法提取天麻多糖工藝的最優參數，并以其作研究對象，以提取率作研究指標，設計L9(34)正交試驗，因素水平見表1。

表1 因素水平表

2.3.2 正交試驗分析 以通過公式(1)得到的天麻多糖含量為研究指標，按表1進行正交試驗分析，結果見表2。由表2可知，對于超聲波輔助法提取天麻多糖的影響最大的因素依次為料液比(B)、提取時間(C)和提取溫度(A)。

表2 超聲波輔助提取正交實驗結果

2.3.3 方差分析 超聲波輔助法提取天麻多糖正交試驗方差分析結果見表3。從表3可知，A因素(F0.05＜F＜F0.01)為有顯著意義，B和C因素(F0.1＜F＜F0.05)為較顯著意義。故根據k的變化率可得到各因素的優先順序為A＞C＞B，即最優工藝組合為提取溫度取65℃，料液比為1:40 g/mL，提取時間為45 min。

表3 方差分析表

2.4 體外抗氧化試驗結果

2.4.1 DPPH自由基清除能力測定結果 由表4可以看出，在一定濃度下，天麻多糖對DPPH自由基的清除率隨著天麻多糖溶液濃度的增大而逐漸提高，當天麻多糖溶液濃度變為3.5 mg/mL時，天麻多糖粗提物的清除率達到38.63%，天麻多糖的清除率達到40.52%，說明天麻多糖含量在一定范圍內有良好的清除DPPH自由基的效果。

表4 DPPH自由基清除能力結果

2.4.2 清除羥基自由基能力測定結果 由表5可得，在一定濃度下，隨著天麻多糖溶液濃度的增大，其羥基自由基清除效果也隨之增強，當天麻多糖溶液濃度變為3.5 mg/mL時，天麻多糖粗提物的清除率最高達到30.36%，天麻多糖的清除率能達到36.52%。說明天麻多糖含量在一定范圍內有良好的清除羥基自由基的效果。

表5 羥基自由基清除能力測定結果

3 討論與結論

本試驗采用熱水浸提法并以超聲波粉碎進行輔助，通過單因素分析法設計L9(34)正交試驗。試驗結果表明，當超聲時間為45 min、液料比為1:40 g/mL、提取溫度為65℃時，天麻多糖的含量最高，可達32.83 mg/g，遠高于采用回流醇沉法提取的云南昭通天麻多糖含量(25.04 mg/g)、陜西略陽天麻多糖含量(23.46 mg/g)、四川汶川天麻多糖含量(23.41 mg/g)、貴州青龍天麻多糖含量(20.67 mg/g)、湖北神農架天麻多糖含量(20.28 mg/g)[29]，但略低于同樣采用超聲波輔助法提取的貴州省德江天麻多糖含量(33.4 mg/g)[30]，這說明在合適的工藝條件下，超聲波輔助熱水浸提法可顯著優化商洛天麻多糖的提取工藝。

本試驗分別采用DPPH法和Feton體系法測定天麻多糖的DPPH自由基和羥基自由基的清除效率，并以此分析判斷天麻多糖的體外抗氧化活性能力。其試驗結果顯示，天麻多糖對DPPH自由基和羥基自由基具有一定的清除作用，且清除能力與濃度成正比。當天麻多糖溶液濃度為3.5 mg/mL時，其對DPPH自由基和羥基自由基分別達到40.52%和36.52%，這說明天麻多糖具有良好的體外抗氧化能力。但這個結果略低于陳琛采用酶提法提取的天麻多糖的體外抗氧化指標（DPPH自由基44.5%，羥基自由基39.5%）[31]。這可能是因為多糖的生物活性與其結構性質具有一定的相關性，而本試驗中的超聲波處理和加熱導致多糖的部分糖鏈斷裂，進而改變了部分多糖的結構和分子量，影響了其體外抗氧化活性[32]。

綜上所述，與熱水浸提法、酶提法及回流醇沉法等方法相比，超聲波輔助熱水浸提法可顯著提升商洛產天麻的多糖提取率，達32.83 mg/g。另外，本方法提取的天麻多糖具有一定的體外抗氧化活性，當溶液濃度為3.5 mg/mL時，其對DPPH自由基和羥基自由基分別達到40.52%和36.52%。