大豆籽粒脂肪酸組分氣相色譜檢測方法的建立

昝光敏，張 玲，張延瑞，盛英華，周 凱，王賢智

（云南大學農學院，昆明650091）

0 引言

大豆[Glycine max(L.)Merr.]是世界上重要的油料作物之一，其產量約占世界油料作物產量的60%[1]。大豆籽粒中含有豐富的營養成分，其中蛋白質含量約40%，脂肪含量約18%～22%[2]。大豆油脂主要由5種脂肪酸組成，分別為棕櫚酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、亞油酸(18:2)和亞麻酸(18:3)，其中棕櫚酸和硬脂酸為飽和脂肪酸，油酸、亞油酸和亞麻酸為不飽和脂肪酸。飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的組分和比例決定了大豆油的品質及用途。富含不飽和脂肪酸的大豆油主要用作食用植物油，其不飽和脂肪酸除了可以滿足人體營養之必需外，還可以起到降低膽固醇的作用，對高血壓及心腦血管疾病也有輔助治療作用[3]。富含飽和脂肪酸的大豆油主要適用于加工制造人造黃油和起酥油，以及廣泛用于工業制造潤滑油、油墨和生物柴油等[4-5]。

大豆籽粒中脂肪酸的提取主要有索氏抽提法、超臨界CO2萃取法與甲酯化提取法[6]。其中索式提取法作為一種國家標準測定方法，雖然精確性高，但操作繁瑣、耗時長且費用高昂[7]。超臨界CO2萃取法提取脂肪酸油脂得率較索氏法高，分離鑒定出的物質也相對較多，所需時間相對較短[8]。甲酯化提取法因其操作簡單，提取率相對較高而被較廣應用[9-10]。

大豆籽粒脂肪酸檢測方法較多，如氣相色譜法(Gas Chromatography,GC)[11-12]、高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)[13-14]和近紅外光譜分析法(Near Infrared Reflectance Spectroscopy,NIRS)[15-17]等，其中氣相色譜法定量檢測大豆籽粒脂肪酸應用最為廣泛[9]。氣相色譜法檢測脂肪酸含量的原理是利用不同脂肪酸的熔點與在色譜柱固定相中保留的時間的相關性，而將不同脂肪酸分離，并根據各組分的出峰時間及峰面積定性定量檢測脂肪酸[10]。已有多位學者對氣相色譜檢測脂肪酸方法優化進行了大量研究。唐芳等[18]對山茶油脂肪酸進行甲酯化，并分析甲酯化振搖溫度以及振搖時間，結果表明：甲酯率隨振搖溫度增加而不斷增高，溫度為70℃時甲酯化程度最好，當溫度超過70℃時，甲酯化副反應程度加強；同時甲酯化率隨振搖時間增加而不斷增高，振搖60 min時甲酯化率最好。于福寬等[6]采用傳統索氏抽提法、改良籽粒直接甲酯化法和豆粉直接甲酯化法3種方法處理樣品進行比較研究，同時選用氣相色譜技術分析大豆5種脂肪酸組分含量，結果表明：傳統索氏抽提法適合樣品量大的研究，檢測精度較高，但較費工費時；豆粉直接甲酯化法適合大量樣品的快速檢測，可以避免長時間加熱對脂肪酸組分的影響，檢測結果相對準確；籽粒直接甲酯化法簡單快捷，但僅適用于樣品量較少的研究。張鳳枰等[19]建立氣相色譜內標法測定水產飼料中脂肪酸含量，測定結果重現性好，可信度高，可簡化脂肪酸檢測周期長，但存在操作步驟繁瑣等問題。

目前，雖然已有多位學者對大豆脂肪酸含量檢測的氣相色譜法檢測方法進行了研究，但都存在甲酯化時間較長、使用試劑較多、色譜條件較復雜等問題[20-21]。因此，本研究采用甲酯化處理方法對大豆5種脂肪酸進行提取，并對提取條件進行優化；通過優化氣相色譜檢測條件，建立基于內標法和外標法的大豆脂肪酸快速、高效的氣相色譜檢測方法，研究結果對大豆脂肪酸含量的快速準確測定及食品檢測等具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

來自不同地區的16份大豆種子（表3）。試驗于2018年12月—2019年11月在云南大學農學院分子育種實驗室進行。

1.2 實驗標準品與分析儀器

標準品：5種脂肪酸標準品，即棕櫚酸，硬脂酸，油酸，亞油酸和亞麻酸，十七碳酸甘油三酯(Triheptadecanoin)標準品及5種脂肪酸甲酯標準品，均購于武漢美泰克科技有限公司。

分析儀器：氣相色譜儀(Thermo Fisher TRACE 1310)；自動進樣器(Thermo Fisher AI-AS 1310)；色譜柱Thermo Fisher RT-Wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

1.3 大豆籽粒脂肪酸甲酯化提取的優化

取30.0 mg大豆粉放入2 mL離心管中，加入1 mL甲醇鈉，水浴加熱間隔搖勻。之后加入1 mL正己烷，2000 r/min離心5 min，取上清液放置于色譜專用樣品瓶中，進行氣相色譜檢測。

水浴加熱設置不同的處理溫度和處理時間，分別為：甲酯化溫度設置40℃、45℃、50℃、55℃和60℃五個梯度；甲酯化時間設置20 min、25 min、30 min、35 min和40 min五個梯度。

1.4 氣相色譜檢測條件優化

進樣量：1 μL；分流進樣方式：分流比25：1，恒流2 mL/min；吹掃流量5 mL/min；進樣口溫度：250℃；檢測器：火焰離子檢測器(FID)，溫度為250℃；載氣：氮氣40 mL/min，氫氣35 mL/min，空氣350 mL/min。

程序升溫方式：以90℃為起始溫度，以20℃/min的速率升溫至160℃，保持1 min；以2℃/min的速率升溫至220℃，保持2 min。

1.5 外標法的建立（大豆脂肪酸標準曲線的繪制）

稱取脂肪酸甲酯標準品10.0 mg放入色譜專用瓶中，用移液槍吸取1 mL正己烷與標準品混合。再從樣品瓶中吸取500 μL溶液放入另一個色譜樣品瓶中，混合均勻，后面的步驟依此類推，用半倍稀釋法對標準品進行稀釋，共設置5個濃度梯度配制（表1）。標準溶液配好后，采用氣相色譜儀對其進行分析，以標準溶液濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

表1 5個濃度梯度混合標準品的配制

1.6 內標法的建立（脂肪酸標準品的甲酯化）

按步驟1.3的方法進行甲酯化，加完甲醇鈉后加入150 μL的內標物（十七碳酸甘油三酯）。

1.7 內標法與外標法的比較

分別用內標法和外標法檢測同一大豆樣品的5種脂肪酸含量的百分比，并對2組數據進行相關性研究。

2 結果與分析

2.1 甲酯化溫度優化

對不同甲酯化溫度下的大豆脂肪酸峰面積進行分析表明：甲酯化溫度在40～60℃時，除了油酸和亞油酸外其他脂肪酸的含量變化差異較小；其中50℃時油酸和亞油酸的含量最高（圖1）。因此，50℃是大豆脂肪酸比較理想的甲酯化溫度。

圖1 不同甲酯化溫度對大豆脂肪酸含量的影響

2.2 甲酯化時間優化

對不同甲酯化時間下的大豆脂肪酸峰面積進行分析表明：大豆脂肪酸的甲酯化時間在20～40 min時，亞油酸對溫度變化較敏感，其他脂肪酸組分隨著時間的變化其含量變化差異較小；當甲酯化時間為35 min時，5種大豆脂肪酸含量均最高（圖2）。因此，35 min是大豆脂肪酸甲酯化的最佳時間。

圖2 不同甲酯化時間對大豆脂肪酸含量的影響

2.3 大豆5種脂肪酸的定性分析

將5種大豆脂肪酸標準品甲酯化后上樣檢測，確定其出峰時間，結果表明：棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸和內標物(TAG-C17)的出峰時間分別為17.18 min、23.95 min、24.72 min、26.40 min、28.76 min和20.44 min（圖3）。十七碳酸甘油三酯的出峰時間與5種脂肪酸的出峰時間相近且互不干擾，所以十七碳酸甘油三酯是較理想的內標物。

圖3 5種大豆脂肪酸的定性分析

2.4 大豆5種脂肪酸標準曲線

將5個濃度梯度的脂肪酸甲酯標準品混合后，采用氣相色譜儀檢測并繪制標準曲線，結果表明：棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸在其濃度范圍內均表現出良好的線性關系（圖4），其中亞麻酸在0.4～0.7 mg表現出良好的線性關系，各脂肪酸組分的判定系數均大于0.98727（表2）。

圖4 5種大豆脂肪酸含量的標準曲線

表2 5種大豆脂肪酸標準曲線相關系數

2.5 內標法與外標法的比較

分別選用內標法(M1)與外標法(M2)檢測16個大豆品種的5種脂肪酸組分含量，然后計算出兩組數據的相關系數，結果表明：內標法和外標法檢測結果幾乎一致（表3）。因此本研究建立的內標法與外標法均適于大豆各脂肪酸組分的定量檢測。

表3 兩種檢測方法所測脂肪酸含量結果比較

續表3

3 討論與結論

3.1 大豆脂肪酸甲酯化提取的優化

由于脂肪酸的沸點較高，高溫下不穩定且容易裂解，分析中容易造成損失。因此對脂肪酸進行甲酯化可以降低沸點，從而提高其穩定性[22]。脂肪酸的甲酯化過程中，處理時間和溫度等因素均會對甲酯化結果產生影響[23-24]。張征等[23]對植物油脂肪酸組分在不同酸催化甲酯化反應的回流時間、回流溫度的影響進行研究，結果表明：當回流溫度為75℃且回流時間為60 min時，脂肪酸的甲酯化反應效果最佳。范勝栩等[25]對改良加熱甲酯化提取法和簡易甲酯化提取法進行對比分析，發現前者脂肪酸提取率更高，但因缺少對不同甲酯化溫度和時間的比較，無法確定大豆脂肪酸的提取條件是否是最優的。牛紅紅等[26]探究了甲酯化溫度和時間對5種脂肪酸含量的影響，但溫度與時間的梯度范圍過大，得到的結果不夠準確。本研究對樣品的前處理過程進行了部分優化和簡化，優化過程為：用30 mg的大豆粉，加入1 mL的甲酯鈉，50℃下甲酯化35 min，之后加入1 mL正己烷萃取一次。與范勝栩等[25]研究相比，本研究在加熱甲酯化提取法的基礎上設置了不同甲酯化溫度和時間梯度，得出了最優大豆脂肪酸甲酯化提取溫度和時間條件，降低了甲酯化處理的溫度，減少了脂肪酸分析中的損失。與牛紅紅等[26]研究相比，本研究省去了一次正己烷萃取和加無水硫酸鈉等過程，試劑使用量減少，因此節約大量時間與成本，減少對環境的污染，進而樣品被甲酯化后穩定性好。同時在繪制5種大豆脂肪酸標準曲線之前，直接對脂肪酸甲酯樣品上樣檢測，省去對樣品甲酯化的繁瑣過程，從而可以減小甲酯化過程帶來的誤差，使標準曲線更加準確。

3.2 氣相色譜檢測條件優化

目前氣相色譜檢測脂肪酸含量的儀器平臺主要有HP 6890 氣相色譜儀[27]、890 氣相色譜儀[28]、Auto System XL氣相色譜儀[29]和Agilent 6890氣相色譜儀[12]等，均存在一定的局限性，如HP 6890氣相色譜儀在使用的過程中，所需試劑較多，耗時長，操作復雜等。本研究使用的分析儀器為賽默飛氣相色譜儀(Thermo Fisher TRACE 1310)，其樣品和標準品可根據程序要求自動進樣，從而縮短了樣品制備所需的時間，提高了結果的準確性，降低人為因素造成的誤差。與苗興芬等[12]研究相比，本研究的檢測器溫度降低25℃，氮氣和氫氣各降低5 mL/min，空氣降低100 mL/min，程序升溫僅需保持3 min，減少了相應的分析時間。雖然本研究對基于賽默飛氣相色譜儀(Thermo Fisher TRACE 1310)檢測平臺氣相色譜條件進行了初步摸索，但是未對進樣溫度、檢測溫度、進氣量等條件進行深入研究，因此在今后的研究中有待進一步的摸索。

3.3 內標法的建立

采用氣相色譜定量分析不同植物的脂肪酸含量有不同的方法，目前主要有歸一法、內標法和外標法等[30]。徐偉東等[27]使用HP6890氣相色譜儀對大豆脂肪酸含量進行檢測，選用十一酸甲酯加叔丁基甲醚制成內標物，比較內標法與歸一法的檢測結果，結果表明：內標法與歸一法測定的結果基本一致。羅玥等[31]通過比較氣相色譜內標法和外標法測定酒中甲醇的檢測結果，結果表明：兩種方法的測定結果沒有明顯差異，但由于內標法可以消除操作等原因引起的干擾而提高分析結果的準確性。張鳳枰等[32]在測定核桃油中的脂肪酸時，建立了以十七烷酸甲酯為內標物的毛細管氣相色譜內標法，結果表明：內標法檢測脂肪酸組分定量準確且重現性好。本研究使用的儀器為賽默飛氣相色譜儀(Thermo Fisher TRACE 1310)，因5種脂肪酸組分在氣相分析時的出峰時間均較長，因此選用十七烷酸甘油三酯作為內標物，結果表明：內標物的出峰時間與待測物相近且互不影響，分離效果良好。同時本研究結果表明，大豆脂肪酸氣相色譜檢測的內標法和外標法檢測結果幾乎一致，可表明兩種檢測方法均適用于大豆各脂肪酸組分的定量檢測。

綜上所述：本研究對大豆脂肪酸甲酯化提取方法進行了優化，最優的甲酯化溫度為50℃，最優處理時間為35 min。優化后的甲酯化提取方法節約了時間和試劑使用量，同時減少了脂肪酸的損失，分析結果更為穩定準確。本研究同時優化了基于賽默飛氣相色譜儀(Thermo Fisher TRACE 1310)檢測平臺的檢測條件，縮短了分析時間和檢測氣體的使用量，并建立了大豆脂肪酸的內標法和外標法檢測方法，明確了內標法和外標法均適用于大豆脂肪酸組分含量的檢測，而內標法更方便快捷且成本較低。