光裸星蟲Sn-hsc70基因克隆及表達分析

黃劍強，魏雯璐 ，鐘如卓，張家煒，楊創業 ,2，王慶恒 ,2

（1廣東海洋大學水產學院，廣東湛江524088；2廣東省海水養殖生物育種工程實驗室，廣東湛江524088）

0 引言

Ritossa[1]首次發現短暫的熱休克能誘導果蠅唾液腺染色體在3個區域出現膨突，該區帶轉錄加強，這一現象被稱為“熱休克反應(Heat shock response,Hsr)”。1974年，有研究工作者[2]在對果蠅唾液腺細胞進行熱休克處理后，分離出一種特殊蛋白質，并證實該蛋白的合成能引起果蠅幼蟲染色體蓬松的現象，這種在熱刺激下產生的蛋白質，被稱為熱休克蛋白(Heat shock proteins,Hsp)。熱休克蛋白70(Heat shock proteins 70,Hsp70)家族，普遍存在于原核及真核生物中，是一類高度保守性的蛋白質[3]。其結構主要分為多肽結合區、ATP酶區和功能不明區三部分[4]，參與蛋白質正確折疊、環境抗逆、細胞凋亡和免疫反應等許多重要生理活動[5]。Hsp70家族可分為4個主要的成員：（1）誘導型 Hsp70(72 kDa)；（2）組成型 Hsc70(73 kDa)；（3）位于內質網的葡萄糖調節蛋白（GRP78或Bip，78 kDa）；（4）位于線粒體的Mtp70(75 kDa)[6-7]。其中Hsc70在正常生理和環境下具有較為穩定的表達，參與了蛋白質的成熟[8]、蛋白質向細胞器的轉運[9]、胞吞作用[10]以及調節細胞凋亡[11]等重要過程。在卵母細胞中，Hsc70 mRNA的沉默會導致燈刷染色體轉錄可逆性的抑制[12]。此外，Hsc70還參與類固醇受體的成熟和信號傳導[13]。這些研究均表明Hsc70對性腺乃至卵母細胞的發育具有重要的作用。

光裸星蟲(Sipunculus nudus)俗稱沙蟲，味道鮮美，營養豐富[14]，廣泛分布于沿海暖水性潮間帶，為中國華南地區重要的珍貴海產品之一，具有較高的經濟價值[15]。近年來，由于近岸環境的污染以及破壞式采捕行為，光裸星蟲的自然資源量明顯下降，這促使廣東湛江、廣西北海、海南儋州等地沿海地區逐漸開展了光裸星蟲的繁殖生物學研究[16-17]和人工養殖試驗[18]。然而，目前光裸星蟲苗種的質量和產量處于很不穩定的狀態，苗種人工繁殖主要受到了光裸星蟲精卵發生的不同步性制約[19]，且光裸星蟲繁殖生物學的研究主要集中在形態學上[16,20]，對于分子機制上研究較少。

本研究通過RACE技術獲得光裸星蟲Sn-hsc70的cDNA全長，并對其進行生物信息學及表達分析，探討Sn-hsc70在光裸星蟲卵母細胞發育過程中的作用。研究結果為深入認識光裸星蟲卵母細胞發育的分子機制積累基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用材料來自湛江市下六鎮，均為有活力、無損傷、規格基本一致(12.92±1.68 g)的光裸星蟲。

用無菌海水沖洗光裸星蟲體表的泥沙，雌雄分開，隨機選取30尾雌蟲，使用2.5 mL無菌注射器抽取體腔液，分離不同時期的卵母細胞，具體方法參考王慶恒等[16]和張家煒[21]，使用100目、150目、300目、500目的細胞篩將卵母細胞按照直徑大小分為O1-O4四個時期（O1：＜48 μm，卵黃形成初期；O2：48～108 μm，卵黃旺盛合成前期；O3：108～150 μm，卵黃旺盛合成后期；O4：＞150 μm，成熟期），收集到腎管中的卵母細胞為O5時期樣品，從腎管中自然排放體外的卵母細胞為O6時期樣品。試驗在廣東海洋大學水產學院實驗室，于2018年6月份進行。

1.2 Sn-hsc70基因全長cDNA克隆

按照Trizol法提取上述實驗樣品的總RNA，NanoDrop 1000微量紫外/可見分光光度計檢測所提取RNA的濃度和質量，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA是否有降解、污染等。選擇經過上述步驟確認合格的RNA樣品依據Reverse Transcriptase M-MLV(NaseH)說明書進行反轉錄合成cDNA。反轉錄產物置于-20℃保存，備用。利用引物設計軟件Primer Premier 6.0，按照引物設計原則設計Sn-hsc70的引物，見表1。

表1 Sn-hsc70基因克隆及熒光定量的引物序列

1.3 Sn-hsc70序列分析

將測序結果導入DNAMAN 8軟件并對其進行拼接，得到Sn-hsc70序列全長；通過在線分析工具ORF Finder預測Sn-hsc70的開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)和并翻譯出氨基酸序列；ProtParam進行蛋白質的理化性質和二級結構預測；ProtScale預測蛋白親水性；NCBI Blast進行氨基酸序列的同源性分析；Phyer2預測蛋白質的三級結構；Pfam進行保守結構域預測；使用Mega X軟件構建生物系統進化樹。在線工具的網址為：ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)；ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）；NCBI Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；Phyer2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi?id=index)； Smart (http://smart.embl-heidelberg.de/)；MEME (http://memesuite.org/index.html)；ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)。

1.4 Sn-hsc70差異表達分析

以60S-L7作為內參基因[19]，通過實時熒光定量PCR(real-time PCR)技術在Roche LightCycler?96在系統上檢測Sn-hsc70基因在光裸星蟲卵子發生各個階段的差異表達。實驗設置3組重復，具體PCR流程參照張家煒等[19]。分析熒光定量PCR結果，SPSS軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，顯著性水平P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 Sn-hsc70基因序列特征分析

Sn-hsc70基因cDNA全長2516 bp，其中5'UTR為 114 bp；3'UTR 為 429 bp，ORF為 1971 bp，編碼656個氨基酸。推導的Sn-Hsc70蛋白除了具有3個Hsp70蛋白家族的3個特征序列(IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSIL、IVLVGGSTRIPKIQK)外，還具Hsc70蛋白特有的連續重復的四肽序列(GGXP)；此外Sn-Hsc70蛋白具有2個核定位序列(DAKRL、KRKYKKDISDNKRAVRR)以及羧基端（C端）的胞質定位序列（EEVD）（圖1）。

圖1 Sn-hsc70 cDNA序列全長及推導的氨基酸序列

2.2 Sn-Hsc70蛋白序列分析

蛋白理化性質預測表明Sn-Hsc70蛋白分子量為71.65 kDa；親水性氨基酸比例遠高于疏水性氨基酸（圖2），總平均親水性(grand averageofhydropathy,GRAVY)為-0.46，屬于親水性蛋白。信號肽及跨膜結構域預測顯示Sn-Hsc70蛋白無信號肽和跨膜結構。蛋白功能位點預測發現，Sn-Hsc70蛋白具有5個N-糖基化位點、1個cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點、5個蛋白激酶C磷酸化位點、16個酪蛋白激酶II磷酸化位點、1個酪氨酸激酶磷酸化位點、20個N-肉豆蔻酰化位點、1個酰胺化和1個ATP/GTP結合位點。Sn-Hsc70蛋白二級結構預測發現α螺旋、β轉角、延伸鏈和無規卷曲分別占整體的40.70%、7.77%、18.14%和33.38%。

圖2 Sn-Hsc70蛋白殘基親水性分布圖

2.3 Hsc70同源蛋白多序列比對

對Sn-Hsc70以及武昌魚(Megalobrama amblycephala,ACC93993.2)、鰱魚(Hypophthalmichthys molitrix,EU816594.1)、草魚(Ctenopharyngodon idella,EU816595.1)、智人 (Homo sapiens,CAA68445.1)、萊桑池蛙(Pelophylax lessonae,ACY69995.1)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis,AAH41201.1)、紫海膽(Strongylocentrotus purpuratus,XP_802129.1)、長牡蠣(Crassostrea gigas,AJ305315.1)的同源Hsc70蛋白進行多序列比對，發現同源Hsc70蛋白之間共有的3個Hsp70家族特征序列高度保守。羧基端（C端）具有連續多次重復的四肽序列(GGXP)以及胞質定位序列(EEVD)（圖3）。

圖3 Hsc70同源蛋白多序列比對

2.4 Sn-Hsc70蛋白三級結構分析

分別對光裸星蟲、雙齒圍沙蠶(Perinereis aibuhitensis,ADR66514.1)和櫛孔扇貝(Azumapecten farreri,AAO38780.1)的Hsc70進行蛋白三級結構的預測分析。結果顯示3個Hsc70同源蛋白三級結構高度保守（圖4）。

圖4 光裸星蟲(a)、雙齒圍沙蠶(b)和櫛孔扇貝(c)的Hsc70蛋白三級結構

2.5 Sn-Hsc70系統發育和結構域分析

對13條Hsc70同源蛋白序列進行系統發育樹構建和結構域預測。結果表明Hsc70蛋白系統發育樹分為無脊椎動物和脊椎動物兩大支，在無脊椎動物中又細分為兩支，一支屬于棘皮動物，另一支包括了軟體動物、星蟲動物以及環節動物。光裸星蟲先與雙齒圍沙蠶聚為一支，再與可口革囊星蟲聚為一支（圖5）。13條Hsc70同源蛋白均具有一個Hsp70蛋白家族結構域，除了長牡蠣結構域較短外，其余12條Hsc70同源蛋白的位置及長度較為一致。

圖5 同源Hsc70的系統發育樹及結構域

2.6 Sn-hsc70表達模式分析

利用qRT-PCR檢測了Sn-hsc70在卵母細胞6個發育時期的表達情況。結果顯示，Sn-hsc70在光裸星蟲卵母細胞發育的各個時期均有表達，整體表達模式呈單峰型。在體腔液發育時期(O1-O4)表達量呈上升趨勢，其中O3和O4時期Sn-hsc70表達量顯著高于其他時期(P＜0.05)。進入腎管后(O5)Sn-hsc70表達量迅速下降，直到卵母細胞的外排后(O6)Sn-hsc70的表達維持在較低的水平，O5和O6無顯著性差異(P＞0.05)。

3 討論

Hsp70家族蛋白包含4個主要成員，其中誘導型的Hsp70與組成型的Hsc70兩者在序列和功能上具有較高的相似性[22]。研究表明，Hsc70與Hsp70均具有Hsp70蛋白家族的3個特征序列(IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSIL、IVLVGGSTRIPKIQK)，不同的是Hsc70蛋白C端具有多個連續重復的四肽序列(GGXP)，而Hsp70在大多數情況下僅有一個GGXP序列[23-24]。本研究發現Sn-Hsc70蛋白具有Hsp70家族的3個特征序列，C端具有4個連續重復的GGXP序列，這些證據表明本研究所克隆獲得的cDNA序列為hsc70基因。

生物信息學分析發現Sn-Hsc70屬于親水性蛋白，在功能位點的搜索中發現了多個蛋白質磷酸化位點及糖基化位點。研究表明蛋白質磷酸化在信號轉導和調控中起著至關重要的作用，糖基化在蛋白質折疊，寡聚化，質量控制，分類和運輸中具有重要的功能[25]。這與Hsc70蛋白參與了類固醇受體的成熟與信號傳導以及蛋白質的折疊、組裝和運輸等過程相吻合[26-27]。

圖6 Sn-hsc70在卵母細胞各發育時期的相對表達量

在正常條件下，Hsc70存在于細胞核及細胞質中，它有助于胞質蛋白（如細胞周期蛋白D1）的入核轉運，因此Hsc70蛋白被認為能在細胞質和細胞核之間移動[28-30]。本研究對包括Sn-Hsc70在內的9條Hsc70同源蛋白進行多序列比對發現所有Hsc70同源蛋白均具有胞質定位序列(EEVD)和兩個核定位序列；這與Hsc70介導胞質蛋白入核轉運功能相吻合。Sn-Hsc70同時具有胞質及細胞核定位序列，推測Sn-Hsc70可能介導了卵母細胞質中一些胞質蛋白的入核轉運。此外，EEVD通過靜電相互作用介導熱休克蛋白組織蛋白(Hsp-organizing protein,Hop)與Hsc70和Hsp90的結合，有助于轉錄因子、激酶以及類固醇激素等底物的組裝和成熟[31]。Sn-Hsc70末端的EEVD序列可能通過與分子伴侶的結合參與某些蛋白的組裝與成熟過程。

研究表明hsc70在人卵巢和胚胎中具有豐富表達，其表達水平遠超肌動蛋白和微管蛋白[32]，這暗示了hsc70對性腺和胚胎發育具有重要的作用。光裸星蟲生殖方式較為特別，無肉眼可見的性腺，卵母細胞游離于體腔液中發育，當營養物質積累完成后，卵母細胞被腎管收集，進行短暫的儲存后由腎口排放于海水中[29]。本研究檢測了Sn-hsc70在卵母細胞6個不同發育時期的表達量，結果表明在體腔液發育過程中(O1-O4)Sn-hsc70的表達逐漸上升，其中從卵黃合成初期進入卵黃旺盛合成期時(O2-O3)表達量顯著上調。研究表明光裸星蟲卵母細胞在體腔液發育過程中可能經歷了G1-P I期（減數分裂間期的G1、S、G2和第一次減數分裂前期P I）[21]，而該減數分裂過程是在一些性激素的調控下啟動的[33]。有研究表明hsc70會響應雌激素和孕激素的刺激而表達量上升[34]。這暗示了體腔液中性激素的刺激可能是導致Sn-hsc70在O1-O4時期表達量上升的原因之一。

一般來說卵母細胞發育過程一般會經歷1～2次停滯過程；第一次停滯發生在PI期，此時形成燈刷染色體(lampbrush chromosome)，并進行旺盛的轉錄翻譯過程，為后期胚胎發育積累充足的營養物質、卵源mRNA以及酶等的物質[35]。有研究表明hsc70參與了卵母細胞燈刷染色體的轉錄活動[12]以及新生蛋白的折疊、組裝、轉移等過程[12]。在光裸星蟲卵母細胞體腔液發育過程中，卵黃等營養物質的大量積累[16]，這可能與Sn-hsc70在O3和O4時期的大量表達有關，說明Snhsc70可能對卵黃形成具有重要作用，而與燈刷染色體之間的關系還有待深入研究。

光裸星蟲脫離體腔液后，卵母細胞失去了體腔液營養物質的供應，蛋白的合成減弱；此時卵母細胞停滯在第一次減數分裂的中期，燈刷染色體凝縮，轉錄也減弱。本研究發現，光裸星蟲卵母細胞脫離體腔液后(O5-O6)Sn-hsc70的表達大幅下降，且表達量顯著低于其他時期(P＜0.05)。這可能與卵母細胞脫離體腔液環境、轉錄與蛋白質合成減弱等過程有關。

4 結論

Sn-hsc70基因全長2516 bp，具有3個Hsp70家族特征序列，2個核定位序列，1個胞質定位序列，以及4次連續重復的GGXP序列。胞質定位序列與核定位序列與Hsc70在細胞質和細胞核之間穿梭的功能相吻合；連續重復的GGXP以及3個Hsp70特征序列是鑒定Hsc70蛋白的重要依據。Sn-hsc70在體腔液發育時期的快速上升可能對卵黃積累具有重要作用；脫離體腔液后，Sn-hsc70表達量顯著下調可能與卵母細胞轉錄與蛋白質合成減弱等有關。