徠卡病理切片系統在動物病理診斷上的應用

沈紅霞，倪柏鋒，虞一聰，王 彬，周 煒，周芷錦，穆 琳

(浙江省動物疫病預防控制中心，浙江 杭州 311199)

病理組織石蠟切片是進行病理診斷的一項基本實驗技術，也是應用于動物疾病病理診斷的常見手段之一。傳統病理切片制作方法從組織取材、固定、脫水、浸蠟、包埋、切片、攤片、烤片、染色和封片都為純手工操作，其中染色環節就涉及十幾個步驟。由于操作程序和環節繁多，制作一張質量優良的切片往往需要數日的時間，而且對制片操作人員技術要求較高。

隨著現代生物醫學研究和儀器自動化發展，全自動脫水機、切片機、染色機等自動化儀器被應用于病理組織切片制作各個環節，逐步實現病理切片制作的自動化，以滿足各大醫療及科研機構日常大通量檢測樣品的場景需求。目前，市場上應用較多的病理設備生產廠家主要有德國徠卡(Leica)、德國美康、英國珊頓、日本櫻花等[1]。自動化病理切片設備一般由軟硬件組成，應用前需要較長時間的熟悉和條件摸索，但操作系統熟悉后具有制片效率高、切片質量穩定、設計環保、操作便捷等優點，還可以結合全切片圖像掃描等技術實現數字化[2]，將為疾病診斷提供更精準的依據。本文將以豬肝病理切片制作為例，詳細介紹Leica病理切片系統的軟硬件操作方法及注意事項。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1組織材料 本實例使用的豬肝樣本取自健康豬屠宰后的新鮮肝臟。

1.1.2試劑與耗材

1.1.2.1 試劑 福爾馬林(上海凌峰，批號：20170925)，石蠟(國藥集團，批號：20160919)，蘇木素-伊紅染色液(Baso，719033)，無水乙醇(上海凌峰，批號：20180301)，二甲苯(國藥集團，批號：20160929)，中性樹脂(上海標本模型廠，批號：20180703)；分化液(1%鹽酸酒精)、1%稀氨水、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇均為本實驗室配制。

1.1.2.2 耗材 一次性切片刀、包埋盒、載玻片、蓋玻片。

1.1.3儀器 Leica ASP300S高級智能脫水機、Leica HistoCore Arcadia C/H石蠟包埋機、Leica RM2235轉輪式切片機、Leica HI1210攤片機、Leica HI1220烘片機、Leica AutoStainerXL自動載玻片染色機(上海徠卡儀器有限公司)、攝影顯微鏡(蔡司)。

1.2方法

1.2.1實驗操作流程 圖1為操作流程。Leica病理切片系統為軟硬件結合系統，應用自帶的智能軟件系統使傳統手工操作中的脫水、浸蠟、透明、染色環節實現自動化，通過溫度、壓力、時間等參數的設定，為制片提供穩定的制作環境。此外，系統中包埋機、攤片機、烘片機的操作便捷，控制穩定，均讓制片質量得到更高保障。

圖1 Leica病理切片系統流程圖示(部分圖片來源于網絡)

1.2.2固定 從動物體取下的新鮮組織，一旦離體盡快放入新鮮配置的10%福爾馬林固定液中進行固定，防止組織發生自溶，保持組織原有的形態學結構。固定液的量應為標本體積的10～20倍，使固定液更均勻迅速地滲透組織內部，固定時間需根據組織塊大小，大體臟器一般不少于24 h，以2～3 d為宜，取材后再固定2～6 h。

1.2.3取材 大體組織固定完成后可根據觀察需求再自行取材，組織塊的理想體積為2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm，根據制片材料特性和目的不同也可適當調整。根據觀察目標選取合適切面，切取組織塊用的刀剪要鋒利，切割時不可來回拖拉，夾取組織時切勿過緊，以免因擠壓而使組織、細胞變形。

1.2.4脫水 首先創建Leica ASP300S脫水機常用程序，首次使用先設定系統日期、蠟缸溫度、試劑列表、試劑站點等參數，再根據需求創建脫水程序和清潔程序，編輯程序步驟運行順序，每個步驟選取試劑，步驟時長，脫水缸溫度及壓力，排液時間和延遲步驟等。本實驗使用脫水程序如下：福爾馬林40 min→水1 h 30 min→75%乙醇1 h 30 min→85%乙醇1 h 30 min→95%乙醇1 h 30 min→無水乙醇55 min→無水乙醇1 h→二甲苯1 h→二甲苯1 h 15 min→石蠟Ⅰ40 min→石蠟Ⅱ 50 min→石蠟Ⅲ 1 h。

脫水機操作流程：(1)打開脫水機開關，根據顯示屏提示時長提前預熱融蠟，一般約10 h左右，石蠟完全融化后才能開始脫水程序；(2)樣本組織塊放入包埋盒，包埋盒放入樣品籃，樣品籃放入脫水缸后蓋緊缸蓋；(3)在“所有程序”中，選擇之前創建的脫水程序，核對執行程序抽取試劑缸順序及相應時長，設置組織塊數和完成時間；(4)點擊開始鍵開始脫水程序，顯示屏顯示開始灌注；(5)脫水完成后點擊確認完成，取出樣品籃中包埋盒后放回脫水缸；(6)選擇清洗程序后自動運行清洗流程；(7)確認清洗程序完成后，點擊“退出程序”，關閉開關。

1.2.5包埋 Leica HistoCore Arcadia H石蠟包埋機可通過控制面板設置蠟缸、托盤和工作區各區域不同溫度，分配器的出蠟量可通過上方的計量旋鈕進行調節，通過按壓壓力夾控制石蠟流出。Leica HistoCore Arcadia C石蠟包埋機是一個具有高制冷性能的冷板，可使工作溫度穩定在-6 ℃。

包埋操作流程：(1)打開包埋機開關，提前預熱融蠟，一般約5 h左右，石蠟完全融化后可開始包埋操作；(2)將脫水缸中取出的包埋盒及包埋模具放入包埋盒托盤中恒溫；(3)用恒溫鑷子夾取包埋模具放置于石蠟分配器下方，按壓力夾加注少量石蠟；(4)取出組織塊放置于包埋模具底部中央，調整組織塊切面朝下并盡量展平；(5)將包埋模具放置于冷卻點定型，放置包埋盒于模具上，再轉移至分配器下，加注石蠟與包埋盒高度齊平；(6)將模具轉移至冷板，使包埋蠟塊凝固；(7)從模具中取出蠟塊，包埋完成，關閉開關。

1.2.6切片 Leica RM2235轉輪式切片機操作流程：(1)切片前可將包埋蠟塊置于4 ℃冰箱約2 h，使蠟塊徹底凝固便于切片；(2)將樣品蠟塊放置于樣品夾上夾緊，向下折收護刀器，松開刀架右側鎖桿，從右邊側面推入一次性舊刀片，確定刀片與壓板上沿平行，旋緊鎖桿夾緊刀片；(3)通過移動鎖桿，調整刀架和刀架底座位置，使刀片與樣品蠟塊接近；(4)緩慢轉動粗修手輪，同時可按住修塊鎖桿，對樣品蠟塊進行粗修直至露出合適的組織切面(粗修桿有10 μm與30 μm兩個修塊級)；(5)粗修完成后，重新安裝新刀片。轉動切片厚度調節鈕，設置切片厚度為3～4 μm，松開右側手輪鎖，順時針勻速轉動手輪開始切片；(6)將連續完整的蠟帶用毛筆掃下，鑷子夾取蠟帶放于攤片機上。

1.2.7攤片 Leica HI1210攤片機操作流程：(1)打開攤片機開關，設定恒定溫度(42 ℃)，待顯示屏上顯示達到恒定溫度；(2)用鑷子將蠟帶輕輕平鋪在水面上，借助水的張力和水的溫度，將略皺的蠟帶自然展平；(3)待蠟帶在恒溫水面上充分展平后，用鑷子輕輕分離出目標蠟片；(4)將載玻片伸入水下，從下往上撈出目標蠟片，貼在載玻片1/3交界處；(5)在載玻片磨砂處標記切片信息，傾斜放置載玻片，去除多余水分待用。

1.2.8烘片 Leica HI1220烘片機是具有良好制熱恒溫性能的電熱板，可使電熱板保持在設定的恒定溫度，操作簡單方便。本實驗所設烘片溫度為59 ℃，將貼有蠟片的載玻片置于電熱板上25 min，以玻片上組織蠟邊熔解為宜。

1.2.9染色 首先創建Leica AutoStainerXL自動載玻片染色機常用程序，設置通用運行參數，包括烤箱溫度，站點中玻片架上下移動次數，從站點中取出玻片架過程時間，向站點中插入玻片架過程時間等。創建染色程序，設置步驟順序編號、試劑站點、孵育時間及孵育時間精確性，一個程序最多可以編輯25個步驟，編輯完程序保存。本實驗采用蘇木素-伊紅染色法(HE染色法)，使用染色程序如下：二甲苯8 min→二甲苯8 min→無水乙醇5 min→無水乙醇4 min→90%乙醇3 min→80%乙醇3 min→70%乙醇3 min→流水沖洗3 min→蘇木素5 min→流水沖洗3 min→1%鹽酸酒精8 s→流水沖洗3 min→稀氨水1 min→流水沖洗3 min→70%乙醇1 min 20 s→80%乙醇1 min 20 s→95%乙醇2 min→伊紅4 s→95%乙醇1 min 20 s→95%乙醇1 min 20 s→無水乙醇5 min→無水乙醇5 min→二甲苯5 min。

染色機操作流程：(1)準備各試劑盒試劑，每盒試劑量至少300 mL；(2)打開染色機開關及連接的水龍頭開關；(3)通過顯示屏及按鍵選擇染色程序后，機器自動進行一次自檢，通過機械臂及傳感器查看各試劑盒是否有試劑；(4)自檢結束，LOAD鍵指示燈亮，將玻片裝載入玻片架卡槽，放置玻片架于LOAD試劑空盒位置；(5)按下LOAD鍵，指示燈滅即自動開始染色程序；(6)染色完成后，EXIT燈亮，按EXIT鍵取出玻片架；(7)關閉機器，染色完成。

1.2.10封片 將玻片從透明劑(二甲苯)中取出，用巴氏吸管吸取中性樹膠1～2滴于切片上，將蓋玻片一側接觸載玻片上的中性樹脂，緩慢放下蓋玻片防止產生氣泡及中性樹脂溢出。

1.2.11鏡檢 將封固的切片放置于光學顯微鏡下觀察，查看染色情況，利用計算機結合顯微鏡攝影系統，及時拍攝鏡檢圖像，以數字化切片圖像形式永久保存病理組織切片最佳觀察狀態。

2 結果

運用該系統脫水后豬肝臟組織軟硬適中，石蠟切片完整，染色清晰鮮艷。將切片置于顯微鏡下鏡檢，可見肝小葉邊界清晰，蘇木素堿性染料將肝細胞核染成藍紫色，核大而圓，居中；伊紅酸性染料將細胞質染成淡粉色；肝細胞以中央靜脈為中心向周圍放射狀排列形成肝索，細胞形態正常，肝索間隙為肝血竇(圖2)。

圖2 豬肝臟組織HE染色(×200)

3 討論

3.1Leica病理切片系統相關注意事項 Leica病理切片系統中包含的大型儀器價格昂貴，只有平時嚴格按照說明書相關要求規范操作，注意保養維護，才能保證制片質量穩定，同時延長機器使用壽命。

Leica ASP300S高級智能脫水機由上部脫水模塊及下部試劑模塊組成，脫水模塊包含觸摸屏，三個蠟缸及一個脫水缸，試劑模塊包含13個試劑瓶和一個冷凝瓶。脫水機試劑柜中福爾馬林固定液、梯度濃度乙醇、二甲苯等試劑，在使用前要檢查各試劑瓶液位是否在警示標志線內，在使用一段時間后，由于試劑揮發或殘留引起濃度降低，要注意定期更換，根據樣本量一般為處理約500個樣本后進行更換，以免影響脫水效果。脫水機脫水缸內有上下兩個液面傳感器探頭，分別為高位和低位報警，試劑長期使用里面融蠟或雜質過多，會造成管道堵塞，或積蠟遮蓋探頭造成錯誤報警，每次使用前可蘸取二甲苯擦洗探頭表面，并注意定期更換試劑，尤其是清洗二甲苯試劑中若出現渾濁，要及時更換試劑[3-4]。此外，每次程序結束后，及時用軟紙將脫水缸內的余蠟擦凈，可延長清洗用二甲苯使用時間，藍色冷凝瓶中的廢液要及時清除。

Leica AutoStainerXL自動載玻片染色機主要由機械臂、試劑容器站點和控制面板三部分組成，其中試劑容器站點包括18個試劑站點，3個沖洗站點，烤箱站點、加載玻片架站點和卸載玻片架站點各1個。整個試劑容器站點和機械臂都被一個透明頂罩密閉，加載和卸載玻片架可通過抽屜完成，而無需打開頂罩，儀器背面連接有進水管和出水管。染色機開機的同時，要打開接水管連接的自來水開關，若長時間未使用再次啟用，需先關閉自來水開關，拆下機器背面接水管，打開水龍頭沖洗管道至出水清澈后復位，再開始后續操作，染色結束后關閉自來水開關；為避免試劑揮發或污染，在使用過程中要蓋上透明防護罩，使用后要蓋上各試劑槽蓋，下次使用時再打開；水槽底部的進水孔容易產生霉菌，要注意及時清潔防止污染堵塞，各試劑也要注意定期更換以免影響染色效果[3]。

3.2在動物疾病診斷方面的應用 病理組織切片作為動物疾病診斷重要參考依據，可實現對組織結構病理變化的直接觀察，有其不可替代的作用。如雞馬立克氏病主要通過臨床癥狀觀察和病理剖檢做初步診斷，但易與淋巴白血病、網狀內皮細胞增殖癥等腫瘤病混淆，通過制作組織病理切片觀察其典型細胞形態和組織結構變化，對其進行病理學診斷，可作為該病診斷的重要參考依據[5-6]。

在動物寄生蟲病診斷方面，傳統方法大多依賴于寄生蟲病原體的檢出，但對于原蟲類寄生蟲肉眼無法直接觀察，及感染早期的幼蟲容易漏檢，探索通過快速制備病理組織切片，結合免疫組織化學(特染)技術、原位PCR等方法診斷寄生蟲病有其自身優勢[7]。已有研究報道，用改良的革蘭氏染色法和甲基綠派諾寧染色法，實現兔腦炎原蟲的快速確診，同時可通過蟲體的外部形態和內部結構觀察判斷宿主所處感染階段，為后期針對性用藥和宿主處置具有指導意義[8]。