離析法在觀察含笑屬植物葉片氣孔結構中的應用

焦亞冰，高志鵬，王容

（南京林業大學生物與環境學院，江蘇 南京210037）

葉片是植物進行光合作用、蒸騰作用和維持自身系統平衡的重要器官。葉片性狀是植物功能性狀中一個重要的部分，關系著植物生物量的積累及對外界資源的獲取和利用。氣孔性狀是葉片結構性狀之一，而葉片結構性狀在很大程度上影響植物的光合生理，進而影響植物的生長狀況。有研究顯示，氣孔保證了植物在不斷更新變換的的環境中持有一定的含水量。近年來，許多學者通過對氣孔性狀特征的研究發現，氣孔在古植物學、地質學和法庭科學物證鑒定等方面都具有重大的研究價值。因此，植物葉片氣孔觀察方法的研究對于深入了解氣孔性狀是一項重要的工作。

植物葉片氣孔的觀察方法主要包括：撕取法、刮制法、印跡法、離析法和電鏡掃描法五種。采用撕取法、刮制法、印跡法和電鏡掃描法等方法觀察氣孔，會存在不同程度的效率低下、程序復雜繁瑣、觀察儀器設備要求高或操作難度大等問題。而離析法的主要原理是利用化學試劑把細胞與細胞間的中層物質溶解，使細胞分離，從而研究細胞的立體形態結構。選用離析法觀察，制片容易、成功率高、表皮上無殘留葉肉，觀察到的氣孔形態真實清晰。

本文以闊瓣含笑（

Michelia cavaleriei

var.

platypetala

）、含 笑（

Michelia figo

）、金 葉 含 笑（

Michelia foveolata

）和深山含笑（

Michelia maudiae

）為試驗材料，詳細介紹了使用離析法觀察含笑屬植物葉片氣孔的試驗操作步驟，以期為科研人員進行氣孔觀察和研究提供具體的方法指導。

1 材料與用具

1.1 植物材料

植物材料為含笑屬闊瓣含笑、含笑、金葉含笑和深山含笑葉片。

1.2 試驗用具

生物顯微鏡（Leica DM 2500，徠卡顯微系統上海有限公司，中國上海）、標準級顯微鏡載玻片（45°角，拋光邊，單頭單面蒙砂，25 mm×75 mm，1～1.2 mm）、免洗蓋玻片（24 mm×60 mm，0.13～0.16 mm，世泰)、燒杯（250 mL，直徑70 mm；10 mL，直徑26 mm）、廣口瓶（1 000 mL，直徑219 mm)、鑷子、短粗玻璃刻度吸管（10 mL）、塑料滴管（3 mL）、剪刀、培養皿（直徑75 mm，高度15 mm）、吸水紙、保鮮膜、一次性口罩、一次性乳膠手套、烘箱（XMTD-8222，上海精宏實驗設備有限公司，中國上海）、高枝剪（ARS 180ZR-3.0-5，日本ARS產品專賣店，中國上海）、自封袋（PE塑料，28 cm×20 cm）。

1.3 試驗藥品

甲醛（廣東光華科技股份有限公司，廣東金華）、冰醋酸（上海申博化工有限公司，中國上海）、硝酸（南京化學試劑有限公司，江蘇南京）、三氧化鉻（國藥集團化學試劑有限公司，中國上海）、番紅溶液、無水乙醇。

2 試驗溶液配制

70%F.A.A.固定液（配方：甲醛5 mL+冰醋酸5 mL+70%乙醇90 mL)

10%鉻酸液（配方：10 g三氧化鉻+100 mL蒸餾水）

硝酸—鉻酸離析液（配方：10%硝酸液和10%鉻酸液等比例混合配制）

1%番紅溶液（配方：番紅1 g+100 mL蒸餾水）

3 試驗操作步驟

3.1 材料采集

2020年9月4日在南京林業大學校園內（118°80′E，32°08′N）闊瓣含笑、含笑、金葉含笑和深山含笑成熟林分中各選取1株，利用高枝剪在樹冠中層外圍東、南、西、北四個方向采摘葉片25片（一般選用植株上有代表性、健康無蟲害、新鮮完好的葉片），每株100片，采集的葉片用自封袋封裝。如果取材距離較遠，可將葉子放在濕報紙里保存帶回。

將采摘的4種含笑屬植物葉片分別清洗干凈，用吸水紙拭去葉片上的水，使葉片保持干凈整潔平整，剪去葉柄，保留葉片中間1/3部分。剪裁葉片時用力均勻，避免組織破裂。

3.2 固定

將預處理過的干凈葉片放入有F.A.A.固定液的廣口瓶中靜置48 h，固定液要完全浸沒葉片。一般固定液的用量要達到葉片體積的20倍以上，否則葉片中的水分會稀釋固定液的濃度，從而影響葉片材料的固定效果，無法達到試驗預期效果。

3.3 沖洗

48 h后，先用鑷子取出固定后的葉片，再用蒸餾水沖洗干凈。沖洗的主要作用是讓蒸餾水滲透到葉片中，徹底把固定液替換出來。

3.4 解離

選取要觀察的部位，將清洗干凈的葉片剪成0.5 cm×0.5 cm的片狀，放入10 mL的燒杯中，倒入硝酸—鉻酸離析液（注意離析液需浸沒葉片），再用保鮮膜將燒杯口密封，放入烘箱在60℃條件下離析，葉片的離析程度以鑷子輕輕夾即完全散開為宜。闊瓣含笑、含笑、金葉含笑和深山含笑的離析時長分別為1 h、0.5 h、2 h和1.5 h。

3.5 再次沖洗

取出離析好的葉片，再用蒸餾水多次反復沖洗，直至沒有任何顏色為止。

3.6 染色

將葉片放入有番紅溶液的培養皿中染色30 s，用鑷子取出放入蒸餾水中清洗。

需要注意的是，配制好的番紅溶液會有一些不溶解的雜質和顆粒，使用前需經過仔細過濾；放置時間過長的番紅溶液會產生沉淀，使用前也需仔細過濾。

3.7 制片

將載玻片和蓋玻片擦凈，用滴管將水滴在載玻片的中央，再用鑷子將染色后的葉片放于載玻片的水滴上，葉片表皮要鋪平且完全展開。隨后用鑷子夾住蓋玻片，使蓋玻片邊緣與材料左邊水滴的邊緣接觸，向下放平蓋玻片，用吸水紙拭去邊緣的水珠。注意，加蓋玻片時盡量避免產生氣泡，如果出現氣泡，需重新制作切片或者從蓋玻片的一側滴清水將氣泡驅走。

3.8 鏡檢

首先，移動旋轉器使低倍鏡對準載物臺的通光孔；其次，將制成的臨時裝片放在載物臺上，用彈簧推片夾夾住；第三，觀察時先用低倍鏡觀察找到物象，再用高倍鏡進行觀察。

低倍鏡使用說明：先轉動粗準焦螺旋，使載物臺緩慢上升或下降，在增大工作距離過程中來調節焦距、尋找物象；再使用細準焦螺旋將葉片表皮的物象調至清晰為止，即可進行氣孔特征的觀察。

高倍鏡使用說明：先在低倍鏡下把需要進一步觀察的部位調到中心，同時把物象調節到最清晰的程度以后，再轉換到高倍鏡下觀察。在轉換鏡頭至高倍鏡時，需要觀察鏡頭工作距離，如果過小，可能壓碎玻片或損壞鏡頭，可提前順時針轉動粗準焦螺旋使載物臺下降。

3.9 拍照

使用連接生物顯微鏡的電腦上的LAS X.lnx軟件（Win7操作系統）進行拍攝保存（見圖1）。

圖14 種含笑屬植物葉片上下表皮氣孔結構的示例（10×）（1 242μm×932μm）

4 結論與討論

（1）離析法主要是使用化學試劑將葉片上下表皮分離成透明狀態，采用F.A.A.固定液可以保存氣孔形態的完整性。離析法觀察到的含笑屬的氣孔形態清晰，便于統計氣孔數目、氣孔開度、氣孔長寬和氣孔密度等指標。而且離析法不僅適用于葉片氣孔觀察，還可適用于導管篩管、葉脈脈序和表皮結構等形態特征觀察。

（2）如圖1所示，含笑屬植物的氣孔器是由兩個腎形的保衛細胞和孔道組成的，形態呈橢圓形，分散在表皮細胞之間，無明顯規律分布。含笑屬植物葉片下表皮分布圖中，葉脈存在的地方是沒有氣孔的存在。試驗過程中，我們發現含笑和金葉含笑單位面積上氣孔數目遠不如闊瓣含笑和深山含笑數目多，這可能與它們的生長環境有關。Peat等1994年的研究表明，氣孔的分布和密度可能受遮陰環境、葉面積大小、葉輪廓、葉片是否有毛、葉片角度和其他生態條件（如海拔）等因素的影響。

（3）在自然界中，不同植物的氣孔數目和分布是不同的，有些植物的氣孔全分布在上表皮或下表皮，也有些植物上下表皮都有氣孔的分布或都沒有氣孔的分布。大多植物的葉片氣孔分布是下表皮多于上表皮的，特別有些木本植物，只在下表皮才有氣孔的分布。在闊瓣含笑、深山含笑、含笑和金葉含笑4種含笑屬植物葉片上表皮沒有氣孔的存在，氣孔只分布于下表皮，這是為了葉片可以更好進行光合作用和蒸騰作用。因此，在進行含笑屬植物葉片氣孔性狀研究時，可直接選取下表皮氣孔作為分析研究的對象。

（4）使用離析法的關鍵是使葉片表皮變透明，這也是為什么不同的材料要考慮不同的離析時長。根據包淑云等研究結果可知，闊瓣含笑、深山含笑、含笑和金葉含笑的葉片厚度、角質層厚度、柵欄組織厚度和海綿組織的厚度有明顯的不同。其中，葉片厚度從大到小順序依次為：金葉含笑、深山含笑、含笑、闊瓣含笑；角質層厚度從大到小順序依次為：金葉含笑、闊瓣含笑、深山含笑、含笑；柵欄組織厚度/海綿組織厚度比從大到小順序依次為：闊瓣含笑、深山含笑、金葉含笑、含笑。因此，4種試驗材料的離析時間不同。

（致謝：本文在寫作過程中受到南京林業大學竹類研究所副教授時培建老師的學術指導，特此表示感謝！）