鈣敏感受體在大劑量瑞芬太尼誘導(dǎo)卵巢癌裸鼠心肌損傷中的作用機制研究

朱燁靜 周惠丹 崔小英 錢琳艷 方軍 姜慧芳 許宏亮

作為婦科惡性腫瘤中惡性程度最高的卵巢癌，約70%發(fā)現(xiàn)時已是晚期[1]。而卵巢癌根治術(shù)創(chuàng)傷大、時間長，使患者在手術(shù)及術(shù)后發(fā)生心血管不良事件的風(fēng)險大大增加。瑞芬太尼作為起效迅速、鎮(zhèn)痛效果確切的一種阿片類藥物，既能確保手術(shù)過程中鎮(zhèn)痛效果良好，又能在手術(shù)結(jié)束后迅速消散，但手術(shù)中大劑量長時間輸注會出現(xiàn)心肌抑制的不良反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，大劑量瑞芬太尼能增加大鼠心肌氧化應(yīng)激，且隨著劑量的增加和輸注時間的延長，心肌損傷程度也不斷加重[2]。但目前對大劑量瑞芬太尼抑制心肌機制的研究甚少。因此，本研究旨在探討鈣敏感受體（calciumsensing recetor,CaSR）在持續(xù)大劑量輸注瑞芬太尼誘導(dǎo)卵巢癌裸鼠心肌損傷中的作用機制及信號通路，以期為防治大劑量阿片類藥物的心肌抑制作用提供有效的靶點。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和材料 Nc-nu裸鼠40只（6～8周，20～25 g）[中國科學(xué)院上海實驗動物中心，許可證號：SCXK（滬）2016-2017]；瑞芬太尼（1 mg/支，國藥準(zhǔn)字：90A08061，湖北宜昌人福藥業(yè)公司）；人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3（廣州富恒生物），CaSR 抗體（200 μg/支，美國 Cell Signaling公司）；蓬亂蛋白同源物（Dvl-1）抗體和βactin（1 mg/支，美國 Santa Cruz公司），β 連環(huán)蛋白（βcatenin）抗體（1 mg/支，美國 Santa Cruz公司）；CaSR 抑制劑 Calhex231（1 mg/瓶，美國 Santa Cruz公司）；蛋白裂解緩沖液（北京索萊寶公司）；蛋白酶抑制劑（PMSF）和辣根過氧化物酶（HRP）（上海碧云天公司）；肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒（南京建成生物醫(yī)學(xué)工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型制備 將40只裸鼠按隨機數(shù)字表法分為空白對照組（C組）、模型對照組（O組）、瑞芬太尼輸注組（R組）和瑞芬太尼+CaSR拮抗劑Calhex231組（R+C組），每組10只。除C組外，O組、R組、R+C組均進(jìn)行卵巢癌模型構(gòu)建：將人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3（卵巢漿液性乳頭狀腺癌）培養(yǎng)于含10% FBS、100 U/ml青霉素和 100 U/ml鏈霉素的 RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2孵箱中孵育，選用對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，制備成107個/ml的懸浮液，在每只裸鼠腋部皮下進(jìn)行注射，皮下移植瘤呈囊形，15 d后基本成瘤，表示建模成功。模型建立后，R組泵注瑞芬太尼20 μg（/kg·min）持續(xù)1 h，R+C組尾靜脈注射濃度為10-3mol/L的 Calhex231（每100 mg給予0.1 μl），48 h后泵注瑞芬太尼20 μg（/kg·min）持續(xù)1 h；C組、O組均輸注等量0.9%氯化鈉注射液。

1.2.2 標(biāo)本采集 注射上述藥物后，即刻于裸鼠內(nèi)眥靜脈內(nèi)取盡血，2 500～3 000 r/min離心5 min，取上層血清備用。斷頸處死裸鼠，取部分心肌組織，4%多聚甲醛中室溫固定18～24 h。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 血清 CK、LDH水平測定 采用酶聯(lián)免疫法檢測血清中CK和LDH水平。操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2 心肌組織常規(guī)病理檢查 心肌組織常規(guī)石蠟包埋，3～5 μm切片，以備HE染色使用。將石蠟切片從4℃冰箱中取出后涼干，60℃烤箱中加熱，二甲苯中脫蠟3次，依次梯度乙醇逐級浸泡，自來水洗，浸入蘇木精染液3～5 min染核，弱堿性水溶液顯藍(lán)30～60 s；0.5%伊紅染色 2～3 min，蒸餾水洗 1～2 s，梯度乙醇逐級脫水，二甲苯透明，并用中性樹膠封片，光鏡下觀察各組裸鼠心肌細(xì)胞損傷情況。

1.3.3 CaSR及Dvl-1、β-catenin蛋白表達(dá)檢測 剩余心肌組織，存儲-80℃冰箱以備提取蛋白使用。采用免疫組化法檢測CaSR表達(dá)及分布情況，藍(lán)染為細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)及膜呈棕色為CaSR表達(dá)。采用Western blot檢測CaSR、Dvl-1、β-catenin蛋白表達(dá)：按每100 mg組織加入150～200 ml蛋白裂解緩沖液及PMSF，充分混勻，4℃下放置40 min，12 000 r/min 4℃離心20 min，取上清液進(jìn)行蛋白定量。按步驟配膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜等，一抗 CaSR（1∶500）、Dvl-1（1∶200）、β-catenin（1∶1 000）和 β-actin（1∶500）4 ℃冰箱孵育過夜，洗膜，將膜放入HRP標(biāo)記的二抗（1∶5 000）中室溫孵育30 min，ECL顯色。應(yīng)用Image J軟件對圖片中條帶進(jìn)行灰度測量，目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，方差齊性兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊采用 Dunnett's T3檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組裸鼠血清CK和LDH水平的比較 與C組及O組相比，R組裸鼠血清CK和LDH水平升高（均P＜0.05），而R+C組無明顯變化（P＞0.05）。與R組相比，R+C組血清CK和LDH水平均明顯降低（均P＜0.05）。見表1。

表1 4組裸鼠血清CK和LDH水平的比較（U/L）

2.2 4組裸鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化 光鏡下可見C組心肌細(xì)胞形態(tài)排列正常，條紋清晰，肌纖維粗而長，細(xì)胞核中染色質(zhì)疏松，密度均勻；O組心肌細(xì)胞形態(tài)排列尚可，少量炎細(xì)胞浸潤；R組心肌組織進(jìn)行性纖維化為特征，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞腫脹，心肌間隙增寬，肌纖維排列紊亂，橫紋不清晰；R+C組心肌細(xì)胞排列略紊亂，少量炎細(xì)胞浸潤，散在的單個心肌細(xì)胞表現(xiàn)為局部肌漿溶解和空泡，而鄰近的心肌細(xì)胞仍正常，無明顯纖維化表現(xiàn)，見圖1（插頁）。

圖1 4組裸鼠光鏡下心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化（HE染色，×200）

2.3 4組裸鼠心肌細(xì)胞CaSR表達(dá)及分布情況 光鏡下可見C組及O組細(xì)胞核藍(lán)染，形態(tài)排列尚可，少量細(xì)胞顯示棕色；R組炎細(xì)胞浸潤和肌纖維排列紊亂同時，CaSR大量分布細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜；而R+C組心肌細(xì)胞質(zhì)少量棕色，形態(tài)排列略紊亂，但無明顯纖維化改變，見圖 2（插頁）。

圖2 4組裸鼠心肌細(xì)胞鈣敏感受體（CaSR）表達(dá)及分布情況（免疫組化，×200）

2.4 4組裸鼠心肌細(xì)胞CaSR、Dvl-1、β-catenin表達(dá)的比較 與 C組及 O組比較，R組中 CaSR、Dvl-1和β-catenin表達(dá)明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；而R+C組心肌組織CaSR、Dvl-1和β-catenin表達(dá)無明顯增加，但與R組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖 3。

圖3 4組裸鼠心肌細(xì)胞上鈣敏感受體（CaSR）、蓬亂蛋白同源物（Dvl-1）、β連環(huán)蛋白（β-catenin）表達(dá)情況（a：各組心肌組織中CaSR、Dvl-1、β-catenin 蛋白電泳圖；b、c、d：各組心肌組織中 CaSR、Dvl-1、β-catenin 蛋白相對表達(dá)量；與 C 組比較，*P＜0.05；與 O組比較，▲P＜0.05；與 R 組比較，△P＜0.05）

3 討論

卵巢癌在我國年發(fā)病率居女性生殖系統(tǒng)腫瘤第3位，且呈逐年上升的趨勢，目前手術(shù)及化療是卵巢癌治療的主要手段。而對于此類手術(shù)，創(chuàng)傷大，時間長，術(shù)中長時間輸注阿片類藥物，使患者容易在圍術(shù)期發(fā)生心血管不良事件。有研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)中短時間平均動脈壓低于55 mmHg，可能發(fā)生心肌損傷及急性腎損傷[3]。因此，對于需要進(jìn)行手術(shù)的卵巢癌患者來說，無疑增加了其心肌損傷的程度和猝死的風(fēng)險。

瑞芬太尼是一種人工合成的新型高選擇性μ受體激動劑，能迅速被血漿非特異性酯酶水解，具有起效快、鎮(zhèn)痛作用強、清除半衰期短、無蓄積、代謝不受肝腎功能的影響等優(yōu)點，目前廣泛應(yīng)用于臨床麻醉。有關(guān)瑞芬太尼對心肌的影響目前存在“保護(hù)”、“損傷”雙向性爭議：有研究認(rèn)為瑞芬太尼對缺血再灌注的心肌具有保護(hù)作用[4-5]；也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)大劑量瑞芬太尼則能增加大鼠心肌氧化應(yīng)激，隨著給藥時間的延長，心肌損傷程度不斷加重[2]。盡管不同研究顯示瑞芬太尼對心臟的影響具有兩面性，但大劑量長時間使用時對心肌損傷的不良反應(yīng)不容小覷。本研究卵巢癌裸鼠進(jìn)行大劑量瑞芬太尼輸注，發(fā)現(xiàn)血清CK及LDH水平增加，與C組及O組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），提示給予一定大劑量的瑞芬太尼，可引起心肌細(xì)胞不同程度的損傷，同時HE染色提示，瑞芬太尼組炎細(xì)胞浸潤明顯，心肌細(xì)胞腫脹，形態(tài)排列紊亂，這些結(jié)果都提示大劑量瑞芬太尼可以導(dǎo)致一定的心肌損傷。而給予CaSR抑制劑后，再輸注同樣劑量瑞芬太尼后，CK和LDH水平并沒有明顯增加，少量心肌炎細(xì)胞浸潤，形態(tài)排列尚可，說明CaSR可能參與了大劑量瑞芬太尼誘導(dǎo)心肌損傷的病理過程。

CaSR是G蛋白耦聯(lián)受體的C家族成員之一，在多種細(xì)胞內(nèi)均有廣泛分布。近年來發(fā)現(xiàn) CaSR涉及了多種分子信號通路，在不同器官和組織中發(fā)揮生理病理作用。有研究報道，CaSR激活后，能介導(dǎo)線粒體通路、Fas死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[6-8]。同時也有研究發(fā)現(xiàn)，CaSR能使NLPR-3炎癥小體活化，繼而介導(dǎo)了Caspase-1依賴的心肌細(xì)胞焦亡分子通路的激活[9-10]。本課題組之前研究發(fā)現(xiàn)CaSR上調(diào)可以介導(dǎo)MAPK途徑的激活引起心肌細(xì)胞凋亡[11]。因此可以肯定，CaSR作為心肌細(xì)胞內(nèi)信號激活，通過細(xì)胞間信號通路匯集、呈遞、交互對話的調(diào)節(jié)，參與了心肌細(xì)胞損傷的過程。本研究結(jié)果也顯示，CaSR在瑞芬太尼誘導(dǎo)卵巢癌裸鼠心肌損傷過程中，起到了一定作用。因此，筆者將繼續(xù)探尋其相關(guān)的分子機制。

Wnt信號通路作為一條潛在、重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在心肌肥厚、動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[12-13]。Wnt/β-catenin信號途徑被譽為“經(jīng)典Wnt信號途徑”：當(dāng)Wnt信號出現(xiàn)后，被激活的Dvl和Fz受體相結(jié)合，啟動了下游相應(yīng)的通路。LRP-5/6與支架蛋白Axin結(jié)合，解離了GSK-3β復(fù)合物，使β-catenin無法降解而在細(xì)胞胞內(nèi)大量聚集，并轉(zhuǎn)位入核，激活了轉(zhuǎn)錄因子如TCF/LEF，從而引起下游靶基因如c-Myc、cyclin等轉(zhuǎn)錄表達(dá)，產(chǎn)生相應(yīng)的功能效應(yīng)[14]。Martin等[15]研究發(fā)現(xiàn)激活Wnt通路后可引起心肌細(xì)胞的肥大。Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控Wnt通路和心肌病的發(fā)生有關(guān)。Malekar等[17]研究發(fā)現(xiàn)在Dvl-1過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，Dvl-1過表達(dá)可導(dǎo)致嚴(yán)重的心肌肥厚，射血分?jǐn)?shù)降低，心臟重量增加，同時在主動脈結(jié)扎和心力衰竭誘導(dǎo)的心肌肥厚模型中Dvl-1的表達(dá)也增加，而Dvl-1敲除的小鼠心肌細(xì)胞β-腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚效應(yīng)消失，證實Dvl-1作為交互對話的重要分子，起著承接Wnt信號通路的關(guān)鍵樞紐作用。本課題組前期也證實，敲除Dvl-1基因后，能抑制心肌凋亡，減輕心肌損傷[18]。本研究中，大劑量使用瑞芬太尼后，裸鼠心肌細(xì)胞中CaSR表達(dá)上調(diào)，同時Dvl-1和β-catenin表達(dá)增加，而CaSR拮抗劑預(yù)處理后，CaSR被抑制，Dvl-1和β-catenin表達(dá)也明顯下降，與R組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這些結(jié)果可以初步說明，在大劑量瑞芬太尼致卵巢癌裸鼠心肌損傷過程中CaSR介導(dǎo)Dvl-1的激活，作為關(guān)鍵樞紐Dvl-1又激活了Wnt/βcatenin通路，從而啟動了心肌損傷的發(fā)生過程。

綜上所述，本研究結(jié)果表明持續(xù)大劑量輸注瑞芬太尼通過激活CaSR介導(dǎo)Dvl-1表達(dá)激活Wnt/βcatenin信號途徑誘導(dǎo)卵巢癌裸鼠心肌細(xì)胞損傷。