化學發光免疫分析技術在新型冠狀病毒肺炎輔助診斷中的應用價值

吳聯朋 朱守寬 毛婷婷 李煥錚 唐少華

目前，新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）核酸檢測是診斷新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的金標準，但存在假陰性等問題。隨著對SARS-CoV-2研究的深入，國家衛生健康委員會發布的《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南》[1]中提出應用SARS-CoV-2抗體檢測可作為COVID-19的輔助診斷。本研究采用化學發光免疫分析技術（chemiluminescent immunoassay,CLIA）檢測SARSCoV-2的IgM和IgG抗體，評估其在COVID-19輔助診斷中的應用價值。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2020年1月31日至3月16日溫州市中心醫院收治的COVID-19住院患者66例（陽性組），其中男 33例，女 33例，平均年齡（46.65±14.28）歲。根據臨床診斷和SARS-CoV-2核酸檢測結果陽性確診為COVID-19。選取同期本院根據臨床診斷和SARS-CoV-2核酸檢測排除COVID-19的發熱患者50例（對照組），其中男25例，女25例，平均年齡（43.80±16.37）歲。兩組患者性別、年齡比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。本研究經本院醫學倫理委員會批準（批件號：L2020-01-059），且所有患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 iFlash3000全自動化學發光免疫分析儀及其配套的SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體化學發光檢測試劑盒（深圳亞輝龍生物科技股份有限公司，批號：20200202），磁珠法核酸提取試劑盒（寧波海爾施基因科技公司，批號：200129001），SARS-CoV-2ORF1ab/N基因雙重核酸檢測試劑盒（上海伯杰醫療科技有限公司批號：20200125E），全自動核酸提取儀（臺灣圓點奈米技術股份有限公司），7500型熒光PCR儀（美國Thermo Fisher公司）。

1.3 標本采集 采集兩組患者清晨空腹靜脈血3～5 ml，置于含分離膠的紅蓋真空采血管內，靜置待血液凝固后，2 500 g離心5 min，排除溶血、脂濁等因素的干擾后取血清備用，其中66例陽性患者不同病程血清樣本179份，50例陰性患者血清樣本50份。同時采集兩組患者鼻咽拭子或深部咳痰標本進行SARS-CoV-2核酸檢測。

1.4 CLIA檢測 血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測采用全自動化學發光免疫分析儀，檢測步驟參照儀器標準操作規程，測試結果以相對發光強度（relative light unit,RLU）表示。樣本中的SARS-CoV-2 IgM或IgG抗體量和RLU之間呈正相關，測定儀根據RLU及內置校準曲線自動計算出SARS-CoV-2 IgM或IgG抗體濃度（AU/ml），以檢測結果≥10.0 AU/ml為有反應性（陽性），＜10.0 AU/ml為無反應性（陰性）。

1.5 SARS-CoV-2核酸檢測 采用熒光RT-PCR技術，針對SARS-CoV-2基因組中開放讀碼框1ab（open reading frame 1ab,ORF1ab）和核殼蛋白（nucleocapsid protein,N）按試劑盒說明書進行檢測。靶基因檢測判讀和SARS-CoV-2核酸檢測陽性判讀以廠家說明書建議為準，對可疑結果通知臨床重新采樣復查。實驗室檢測結果確診為陽性需滿足同一份標本中SARSCoV-2的ORF1ab及N基因檢測同時陽性，或同一患者不同的兩份標本中SARS-CoV-2的ORF1ab或N基因檢測陽性。

1.6 統計學處理 采用SPSS Statistics 22.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。計算CLIA檢測SARS-CoV-2 IgM抗體、IgG抗體以及兩者聯合檢測的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值。統計不同病程IgM、IgG和兩者聯合檢測的陽性率（用樣本采集日期減去癥狀出現日期得到患者的發病天數），采用Excel 2016軟件對發病天數、IgM、IgG和兩者聯合檢測結果進行統計分析。

2 結果

2.1 CLIA檢測SARS-CoV-2抗體結果分析 SARSCoV-2 IgM抗體檢測靈敏度為57.54%（103/179），特異度為 92.00%（46/50），陽性預測值為 92.26%（103/107）,陰性預測值為37.70%（46/122），符合率為65.07%（149/229）。SARS-CoV-2 IgG抗體檢測靈敏度為88.27%（158/179），特異度為96.00%（48/50），陽性預測值為98.75%（158/160），陰性預測值 69.57%（48/69），符合率為89.96%（206/229）。SARS-CoV-2 IgM聯合IgG抗體檢測靈敏度為88.83%（159/179），特異度為88.00%（44/50），陽性預測值為96.36%（159/165），陰性預測值68.75%（44/64），符合率為 88.65%（203/229）。見表 1。

表1 CLIA檢測SARS-CoV-2抗體結果分析（份）

2.2 不同病程SARS-CoV-2抗體檢測結果分析 將66例確診COVID-19患者的179份血清樣本按病程分為 0～7 d、8～14 d、15～21 d、22～28 d、29～35 d、36～42 d、＞42 d 7個組，CLIA檢測SARS-CoV-2 IgM、IgG、聯合檢測IgM和IgG抗體的陽性率見表2。IgM抗體從發病的0～7 d開始檢出，隨著病程的進展陽性率逐漸升高，在22～28 d到達峰值，檢出率為90.91%，此后陽性率逐漸下降，＞42 d后陽性率下降至23.32%。IgG抗體同樣也在0～7 d開始檢出，在22～28d到達峰值，檢出率達到100%。不同于IgM抗體，IgG抗體陽性率在病程的29～35 d、36～42 d、＞42 d 依舊保持在較高水平。IgM 和IgG抗體聯合檢測陽性率和單獨檢測IgG相仿。

表2 不同病程SARS-CoV-2抗體檢測結果分析[份（%）]

3 討論

SARS-CoV-2是一種新型β屬冠狀病毒，屬正冠狀病毒亞科，是繼SARS-CoV和 MERS-CoV等6種冠狀病毒之后，可以感染人類的第7種冠狀病毒[2-5]。

2020年1月20日，中國疾病控制中心（CDC）宣布將該病納入國家“乙類”傳染病，采取“甲類”傳染病防控措施。對疑似患者及時準確地診斷，盡早隔離收治，是防控的重要環節。目前，SARS-CoV-2核酸檢測是診斷COVID-19的常用方法和金標準，但是SARS-CoV-2核酸檢測結果為假陰性的情況不斷地被提及，這其中與樣本采集的質量，病毒RNA易降解，標本的前處理方式方法、病毒存在變異、核酸試劑盒本身質量問題等因素相關[6]。隨著對SARS-CoV-2認識和探索的不斷深入，血清抗體檢測已經成為COVID-19的一種輔助診斷方式。

目前，中國有多家試劑廠家研發出針對SARSCoV-2 IgM和IgG抗體的免疫檢測試劑盒，其中包括膠體金法和CLIA。而CLIA具有靈敏度高、線性范圍寬、高通量、操作簡單等優點，已經普及到對人類免疫缺陷病毒、梅毒等病原體抗體的臨床檢測當中[7]。SARSCoV-2是一種全新的病毒，且體外抗體檢測不可避免地存在假陽性和假陰性的問題，所以CLIA的檢測靈敏度和特異度有必要進行充分驗證。本研究結果顯示，CLIA檢測SARS-CoV-2 IgM抗體診斷COVID-19的靈敏度、特異度分別為57.54%、92.00%，檢測IgG抗體診斷COVID-19的靈敏度、特異度分別為88.27%、96.00%，和徐萬洲等[6]研究結果相接近，提示了CLIA檢測SARS-CoV-2抗體在診斷COVID-19方面有良好的靈敏度和特異度，且重復性較好。

當病原體感染人體后，人體免疫系統會對病原體進行免疫防御并產生特異性抗體。IgM抗體通常在1周內產生，提示有近期感染。IgG抗體晚于IgM抗體出現，但由于在體內能存在較長時間，檢測可鑒別急性感染和既往感染[8]。本研究結果顯示，SARS-CoV-2 IgM抗體從發病的0～7 d開始產生，隨著病程的進展陽性率逐漸升高，在22～28 d到達峰值，檢出率達90.91%，此后陽性率逐漸下降，在36～42 d還保持53.85%的陽性率，超過42 d后則下降至23.32%，說明部分患者超過6周后體內IgM抗體還存在，具體IgM抗體多久會消失則需要更長時間的隨訪檢測。IgG抗體同樣也在0～7 d開始檢出，在22～28 d到達峰值，檢出率達到100%，直至42 d依舊保持著94.59%的陽性率，說明了SARS-CoV-2 IgG抗體在體內存在更久，但滴度是否逐漸降低則需要更多檢測結果驗證。本研究中IgG抗體陽性率全程大于IgM抗體，在病程的中后期不難理解，但在病程早期的0～7 d同樣是IgG大于IgM，或許和檢測方法本身的靈敏度相關。

CLIA檢測SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體只需110 μl血清標本，標本較為容易獲得，同時操作較為簡便，對實驗室環境、設施等要求比PCR實驗室低，實驗室人員面對的風險較核酸檢測低，從上機檢測到出結果需要大約40 min，可作為疑似患者核酸檢測陰性時的一種補充檢測，或與核酸檢測協同使用診斷疑似SARSCoV-2感染者[9]。CLIA又是一種定量的檢測技術，相比核酸檢測與膠體金法抗體檢測等定性方法，可以數字化更直觀地呈現患者體內抗體的濃度，不僅可以輔助診斷COVID-19，對患者的治療效果監測和病程預后評估有重要的提示作用。

綜上所述，CLIA檢測SARS-CoV-2抗體具有良好的靈敏度和特異度，在病程的22～28 d檢測陽性率最高，該方法簡便、快捷，對COVID-19有輔助診斷價值。