活化淋巴細胞免疫治療對不明原因復發性流產的療效和機制探討

劉 璐，張 慧

[中國科學院大學深圳醫院（光明）產一科，廣東 深圳 518107]

復發性流產是婦產科臨床中的常見疾病，醫學研究發現，不明原因的復發性流產在所有復發性流產中占比40%～50%，已成為臨床治療中的重點與難點[1]。自上世紀80年代以來，臨床開始應用淋巴細胞主動免疫療法治療復發性流產，但仍有近30%的患者治療后仍無法成功妊娠[2]。目前有研究發現，通過對淋巴細胞群體進行白介素-2（IL-2）、白介素-12（IL-12）體外活化，刺激其增殖后，可提升淋巴細胞主動免疫療法的治療效果[3]。對此，本次研究回顧性分析110例不明原因的復發性流產患者的臨床資料，旨在探究活化淋巴細胞免疫治療對不明原因復發性流產的療效與機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料對中國科學院大學深圳醫院（光明）2017年1月至2019年10月收治的110例不明原因復發性流產患者的臨床資料進行回顧性分析，根據治療方法的不同分為A組與B組，各55例。A組患者年齡22～42歲，平均（32.03±3.75）歲；流產次數2～5次，平均（3.43±1.15）次。B組患者年齡25～40歲，平均（31.57±3.68）歲；流產次數2～5次，平均（3.23±1.17）次。兩組患者一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），組間具有可比性。本研究經院內醫學倫理委員會批準。納入標準：有2次及以上的自然流產史；夫妻雙方染色體G帶染色體核型分析正常，無家族遺傳病史；無明顯生殖道畸形或者形態學異常；無生殖道感染，生殖內分泌激素檢查均正常；封閉抗體陰性；月經周期正常，排卵正常；抗丈夫淋巴細胞毒性試驗呈陰性；研究前3個月未經任何免疫治療或接種；未使用過任何調節免疫功能類藥物；男方精液分析正常。排除標準：伴有惡性腫瘤者；臨床血常規檢查結果存在異常者；近3個月內接受過免疫治療、疫苗接種或者應用過調節免疫功能藥物者。

1.2 方法 A組患者進行常規淋巴細胞免疫治療，從計劃妊娠前3個月開始，由配偶提供外周靜脈血20 mL制作免疫原，采用密度梯度離心法分離淋巴細胞，無菌生理鹽水洗滌3次，清除血小板，以生理鹽水稀釋淋巴細胞懸液至濃度為（2～4）×107個/mL，從患者雙側前臂內側選取4～6點進行皮下注射，0.2～0.3 mL/點，30 min后觀察局部是否發生水泡、紅腫、血腫等，每2周注射1次，4次為1個療程。B組患者進行活化淋巴細胞主動免疫治療，按照A組的方法獲取淋巴細胞，用IL-2、IL-12對細胞進行活化增殖刺激，37 ℃培養箱中培養72 h后收集活化后的淋巴細胞，按照A組的方法稀釋淋巴細胞并對患者進行注射治療，劑量與頻率同A組。完成免疫治療后2周檢測患者的封閉抗體，結果顯示陽性則建議計劃妊娠。確定妊娠后，每間隔3周分別再按上述免疫治療方法繼續進行鞏固免疫治療直至妊娠16周。

1.3 觀察指標①在首次治療前、治療1個療程后的2周，抽取患者的外周靜脈血5 mL，經3 000 r/min離心10 min分離血清，采用酶聯免疫吸附法檢測封閉抗體；凡是封閉抗體轉為陽性者，即可進行指導受孕。②外周血淋巴細胞Fas的檢測，血液采集方法同①，用流式細胞儀檢測外周血CD4+CD95+、CD8+CD95+、CD56+CD95+百分比。③采用酶聯免疫吸附法檢測血清γ-干擾素（INF-γ）、白介素-4（IL-4）水平，血液采集與處理方法同①。④凡是孕期＞16周超聲提示活胎者可被定義為治療成功，對兩組患者的妊娠結局進行統計比較。

1.4 統計學方法采用SPSS 21.0統計軟件分析數據，計數資料用[例(%)]表示，采用χ2檢驗；計量資料用表示，采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 封閉抗體轉陽率 B組患者治療后封閉抗體轉陽率顯著高于A組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組患者封閉抗體轉陽率比較[ 例(%)]

2.2 Fas 表達情況兩組患者治療后外周血CD8+CD95+、CD56+CD95+百分比均較治療前顯著降低，且B組患者外周血CD4+CD95+、CD8+CD95+、CD56+CD95+百分比均顯著低于A組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者Fas 表達情況比較( , %)

表2 兩組患者Fas 表達情況比較( , %)

注：與治療前比，*P＜0.05。

CD4+CD95+ CD8+CD95+ CD56+CD95+治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后A 組 55 18.88±3.28 18.56±1.75 14.08±2.33 11.76±2.87* 15.56±1.76 11.67±1.37*B 組 55 18.09±3.42 17.26±1.33 13.36±1.69 9.52±2.44* 15.19±1.12 9.22±1.06*t 值 1.236 4.386 1.855 4.409 1.315 10.489 P 值 ＞ 0.05 ＜ 0.05 ＞ 0.05 ＜ 0.05 ＞ 0.05 ＜ 0.05組別 例數

2.3 細胞因子指標治療后兩組患者血清INF-γ 水平均顯著降低，B組顯著低于A組，B組患者血清IL-4水平均顯著升高，且顯著高于A組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表3。

表3 兩組患者細胞因子指標比較()

表3 兩組患者細胞因子指標比較()

注：與治療前比，*P＜0.05。INF-γ：γ-干擾素；IL-4：白介素-4。

組別 例數 INF-γ(μg/L) IL-4(pg/mL)治療前 治療后 治療前 治療后A 組 55 15.23±1.97 13.56±1.82* 9.67±2.22 10.45±2.65 B 組 55 15.33±1.65 12.18±1.54* 10.37±3.18 13.65±2.33*t 值 0.293 4.293 1.339 6.725 P 值 ＞ 0.05 ＜ 0.05 ＞ 0.05 ＜ 0.05

2.4 妊娠結局 B組患者總治療成功率顯著高于A組，流產率顯著低于A組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表4。

表4 兩組患者妊娠結局比較[ 例(%)]

3 討論

目前醫學界將不明原因復發性流產定位為一種免疫性疾病，其治療以主動免疫療法與被動免疫治療為主。上世紀80年代初期，就有學者開創了淋巴細胞主動免疫療法，該治療方法可誘導母體產生足量的封閉抗體，降低了自然殺傷細胞（NK細胞）的數量與活性，調節機體細胞因子的生成，使得母體產生一種微嵌合的狀態，而這些生理上的改變都將改善最終的妊娠結局[4]。有研究數據顯示，接受了淋巴細胞主動免疫治療后，不明原因復發性流產患者的妊娠成功率高達60%及以上，這個成功率遠遠高于沒有接受過淋巴細胞免疫療法的患者[5]。但是研究還發現，臨床上仍有30%左右患者經過常規性淋巴細胞免疫治療后，仍無法取得有效的治療效果[6]。因此，在常規性免疫治療的基礎之上如何提升整體治療效果，提高不明原因復發性流產患者的妊娠率與活產率是研究復發性流產治療方法的新難題與關鍵點。活化淋巴細胞免疫治療過程中主要應用IL-2、IL-12對細胞進行活化增殖刺激，其中IL-2可促進淋巴細胞增殖分化和誘導產生細胞毒活性，IL-12單獨不能引起淋巴細胞增殖，但可誘導淋巴細胞產生細胞毒活性，與IL-2協同可以使這種效應明顯增強。本研究的結果顯示，B組患者治療后封閉抗體轉陽率顯著高于A組，總治療成功率顯著高于A組，流產率顯著低于A組，提示應用了活化淋巴細胞免疫治療后，不僅提高了患者的封閉抗體的轉陽率，同時還提升了不明原因復發性流產患者的妊娠率，降低了流產率，改善了妊娠結局，治療效果較為明顯。

不明原因復發性流產患者的發病原因復雜，可能的發病機制為染色體異常、內分泌紊亂、生殖道異常、感染等；隨著對疾病研究的深入，從生殖免疫學角度來說，正常情況下，母體與胚胎、胎兒之間可以建立免疫平衡，讓其穩定生長，而不明原因復發性流產的發生可能與孕期母體對胎兒來自父系抗原呈低識別和低反應，無法產生足夠的保護性封閉性抗體，從而導致免疫動態失衡，一旦無法達成這種平衡，母體將對胚胎、胎兒產生嚴重的免疫排斥，造成流產的發生[7-8]。本研究中，治療后B組患者外周血CD4+CD95+、CD8+CD95+、CD56+CD95+百分比均顯著低于A組，血清INF-γ 水平顯著低于A組，血清IL-4水平顯著高于A組，提示活化淋巴細胞免疫治療可能是通過降低外周血淋巴細胞Fas表達，調控血清INF-γ、IL-4水平，促進Th1/Th2細胞因子恢復平衡而發揮治療作用。

綜上，與常規淋巴細胞免疫治療相比，活化淋巴細胞免疫治療不明原因復發性流產患者的封閉抗體轉陽率升高，同時改善了患者的妊娠結局，可能與降低外周血淋巴細胞Fas表達，調控血清INF-γ、IL-4水平有關，值得臨床推廣。