響應面優化海鮮菇副產物黃酮類化合物提取工藝

賴譜富，李怡彬，翁敏劼，湯葆莎，吳俐，陳君琛

摘要：利用響應面法對海鮮菇副產物黃酮類化合物的提取工藝進行優化。在單因素試驗基礎上，選擇料液比、提取溫度、提取時間、乙醇濃度為自變量，黃酮類化合物得率為響應值，利用響應面分析法研究各自變量交互作用及其對黃酮類化合物得率的影響，模擬得到二次多項式回歸方程的預測模型。結果表明：海鮮菇副產物黃酮類化合物最佳提取工藝條件為料液比1∶28、提取溫度50℃、提取時間14 h、乙醇濃度58%、振蕩速率120 r·min-1，在此工藝條件下黃酮類化合物得率為341 mg·g-1。

關鍵詞：海鮮菇;副產物;黃酮類化合物;提取;響應面法

中圖分類號：TS 2555 文獻標志碼：A 文章編號：0253-2301（2021）02-0001-06

DOI： 1013651/jcnkifjnykj202102001

Optimization of Extraction Process for Flavonoids from the Byproducts of

Hypsizygus Marmoreus by Response Surface Methodology

LAI Pufu， LI Yibin， WENG Minjie， TANG Baosha， WU Li， CHEN Junchen

（Research Institute of AgriEngineering Technology， Fujian Academy of Agricultural Sciences/Agricultural

Product Processing Research Centre， Fujian Academy of Agricultural Sciences/National R & D Center For

Edible Fungi Processing Technology， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： The response surface methodology was used to optimize the extraction process of flavonoids from the byproducts of Hypsizygus marmoreus. On the basis of the single factor experiment， the solidliquid ratio， extraction temperature， extraction time and ethanol concentration were selected as the independent variables， and the yield of flavonoids was selected as the response value. Then， the interaction of each independent variable and its effect on the yield of flavonoids were studied by using the response surface method， and the prediction model of quadratic polynomial regression equation was obtained by simulation. The results showed that the optimal extraction conditions of the flavonoids from the byproducts of Hypsizygus marmoreus were as follows： the solidliquid ratio of 1∶28， extraction temperature of 50℃， extraction time of 14 h， ethanol concentration of 58%， and oscillation rate of 120 r·min-1. Under these conditions， the yield of the flavonoids was 341 mg·g-1.

Key words： Hypsizygus marmoreus; Byproduct; Flavonoids; Extraction; Response surface methodology

海鮮菇Hypsizygus marmoreus又名蟹味菇、真姬菇，富含蛋白質、黃酮、多糖、酚類以及微量元素等成分，具有抗氧化、消炎、抗腫瘤、降血脂、調節免疫等功效＼[1-3＼]，其在采收加工過程會產生5%～10%的副產物，當前大部分當作垃圾直接丟棄，既浪費資源又對人居環境造成污染＼[4＼]。目前關于海鮮菇副產物的營養品質，相關學者也進行了一些研究，林忠寧等＼[4＼]研究發現，真姬菇菇腳和菌糠蛋白質中總氨基酸含量為7150%和6592%，氨基酸種類齊全，具有較高的蛋白質營養價值;于洪超等＼[5＼]研究發現，真姬菇菌腳的多糖、總酚、黃酮、灰分及粗纖維等含量是子實體的142、102、121、115、169倍，開發利用價值較好;王麗等＼[6＼]研究發現，海鮮菇的蓋、柄、根、幼菇及殘菇中必需氨基酸模式與人體要求較接近，與其他食物營養搭配可提高營養價值;陶明煊等＼[7＼]研究發現，真姬菇菌柄中多糖、蛋白質含量均高于菌蓋，其多糖清除超氧自由基和羥自由基能力較強。

黃酮類化合物在自然界廣泛分布，因其毒性低、藥理活性強等，在化妝品、醫藥、食品等工業中應用廣泛＼[8＼]。目前，國內外學者對黃酮物質的提取已有眾多研究，主要有水提取法、超聲波提取法、有機溶劑提取法、生物酶解提取法、超臨界萃取法、微波提取法、大孔樹脂吸附法、加壓流體提取法等＼[9-10＼]，每種方法都有其優缺點。呂鵬濤等＼[11＼]以工廠化海鮮菇菇根為原料，采用超聲波輔助法提取總黃酮，總黃酮提取含量可達2178 mg·g-1;黃敏＼[12＼]研究蟹味菇總黃酮的超聲提取工藝條件，在料液比1∶40、75%乙醇、70℃下超聲提取20 min，總黃酮含量達0061%，但未見以海鮮菇副產物為原料提取黃酮類化合物的報道。本研究在前期研究的基礎上，選用乙醇振蕩法對海鮮菇副產物黃酮類化合物進行提取，在單因素試驗探討黃酮類化合物得率受液料比、提取溫度、提取時間及乙醇濃度影響的基礎上，應用響應面法對主要影響因素水平進行優化，為海鮮菇副產物黃酮類化合物提取的產業化提供依據。

1材料與方法

11材料與試劑

賴譜富等：響應面優化海鮮菇副產物黃酮類化合物提取工藝2021年第2期2021年第2期賴譜富等：響應面優化海鮮菇副產物黃酮類化合物提取工藝海鮮菇副產物系正常生長110～120 d后，采收分揀時未達到商品海鮮菇規格的小菇（菌蓋直徑小于15 cm，菌柄長度小于4 cm），由福建省同興菌業有限責任公司提供。新鮮海鮮菇副產物清洗后60℃熱泵烘干，含水率為82%左右。

蘆丁標準品、三氯化鋁、無水乙醇、醋酸鉀均為分析純。

12儀器與設備

BS2000S型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）; SP756P型紫外分光光度計（上海光譜儀器有限公司）;RE501型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）;DLK2020型低溫冷卻循環泵（寧波新芝生物科技股份有限公司）;粉碎機（江蘇常州宇通干燥設備有限公司）;SPH103B型恒溫培養振蕩器（上海世平實驗設備有限公司）。

13試驗方法

131工藝流程海鮮菇副產物→60℃條件下熱泵烘干→粉碎后過50目篩→乙醇振蕩法提取（振蕩速率120 r·min-1）→測定黃酮類化合物得率。

132海鮮菇副產物黃酮類化合物的測定采用蘆丁比色法＼[13＼]。

（1）標準曲線的制作。分別精確移取0、1、2、3、4、5 mL的蘆丁標準品溶液于50 mL帶塞比色管中，由于最后定容為15 mL，相當于0、03、06、09、12、15 mg的蘆丁質量。于標準管中分別加入2 mL 三氯化鋁溶液混勻，各加入2 mL醋酸鉀溶液混勻，加入30%乙醇定容至15 mL，混勻，靜置10～15 min，最后于415 nm處測定吸光值（B）。以蘆丁標準品濃度A為橫坐標，吸光度值B為縱坐標繪制標準曲線，并通過線性回歸，得到回歸方程B=05885A+00078，R2=09991。

（2）海鮮菇副產物黃酮類化合物的測定。精密吸取海鮮菇副產物黃酮類化合物樣品溶液10 mL置于50 mL帶塞玻璃比色管中，按蘆丁標準曲線法測定黃酮類化合物含量，根據下列公式計算得率。

黃酮類化合物得率X=A/（m×V1/V2）

式中：X為試驗中黃酮類化合物含量（以蘆丁計），mg·g-1;m為試樣的質量，g;A為測定用樣液中蘆丁的質量，mg;V1為測定用樣液的體積，mL;V2為試樣處理液的總體積，mL。

14試驗設計

141海鮮菇副產物黃酮類化合物提取單因素試驗（1）料液比對海鮮菇副產物黃酮類化合物得率的影響。按料液比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35分別加入60%的乙醇，在120 r·min-1、50℃下振蕩提取15 h，每個試驗提取1次，重復2次。探討海鮮菇副產物黃酮類化合物的得率受料液比的影響。（2）提取溫度對海鮮菇副產物黃酮類化合物得率的影響。按料液比1∶25加入60%乙醇，分別在溫度40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下120 r·min-1振蕩提取15 h，每個試驗提取1次，重復2次。探討海鮮菇副產物黃酮類化合物的得率受提取溫度的影響。（3）提取時間對海鮮菇副產物黃酮類化合物得率的影響。按料液比1∶25加入60%乙醇，在50℃、120 r·min-1下分別振蕩提取05、10、15、20、25 h，每個試驗提取1次，重復2次。探討海鮮菇副產物黃酮類化合物的得率受提取時間的影響。（4）乙醇濃度對海鮮菇副產物黃酮類化合物得率的影響。按料液比1∶25分別加入30%、40%、50%、60%、70%的乙醇，在50℃、120 r·min-1下振蕩提取15 h，每個試驗提取1次，重復2次。探討海鮮菇副產物黃酮類化合物的得率受乙醇濃度的影響。

142海鮮菇副產物黃酮類化合物提取響應面試驗設計綜合單因素試驗結果，本試驗根據BoxBenhnken中心組合試驗設計原理，選取影響海鮮菇副產物黃酮類化合物得率的主要影響因素料液比（X1）、提取溫度（X2）、提取時間（X3）及乙醇濃度（X4）為試驗因素，以黃酮類化合物得率為響應值，進行4 因素3 水平響應面分析試驗，優化海鮮菇副產物黃酮類化合物提取工藝條件。因素水平編碼見表1。

15數據統計分析

采用DesignerExpertV 8061對試驗數據進行回歸分析。

2結果與分析

21單因素試驗結果

211料液比對海鮮菇副產物黃酮類化合物得率的影響從圖1可知，隨著料液比的增大，海鮮菇副產物黃酮類化合物得率先增大后減小，料液比為1∶25～1∶30的增幅趨勢比1∶15～1∶25的趨勢稍大，料液比1∶30后得率變小。這可能是因為海鮮菇副產物與乙醇的直接接觸面積隨著料液比的增大而增加，黃酮類化合物成分也隨之更多溶解出來，但是當料液比超過1∶30時，雜質的溶出也隨之增大，進而導致黃酮類化合物得率減小＼[14＼]。

212提取溫度對海鮮菇副產物黃酮類化合物得率的影響由圖2可知，隨著溫度的提高，海鮮菇副產物黃酮類化合物得率先增大后減小，在40～50℃增加幅度較大，之后呈緩慢下降趨勢。一般來說，溫度越高黃酮類化合物成分的溶出速率越快，但溫度過高也會造成黃酮類化合物得率下降，這可能是因為高溫破壞了海鮮菇副產物黃酮類化合物，且高溫直接增加雜質的溶出，干擾黃酮類化合物含量的測定。

213提取時間對海鮮菇副產物黃酮類化合物得率的影響圖3表明，提取時間在05～15 h，海鮮菇副產物黃酮類化合物的得率呈上升趨勢，15 h后黃酮類化合物得率有所下降。這可能是因為黃酮類化合物成分在短時間內未充分溶出，其溶出率隨著提取時間的延長而增加，但黃酮類化合物組分在過長提取時間下會被破壞，從而導致得率降低＼[14＼]。

214乙醇濃度對海鮮菇副產物黃酮類化合物得率的影響從圖4可以看出，隨著乙醇濃度的增大，海鮮菇副產物黃酮類化合物得率先增大后減小，乙醇濃度60%時得率最大。這可能是因為海鮮菇副產物黃酮類化合物的極性與60%乙醇的極性相似，同時脂溶性物質會隨著乙醇濃度的升高而加速溶出，進而導致黃酮類化合物得率降低＼[15＼]。

22響應面試驗結果及方差分析

響應面試驗設計與結果見表2。經多元回歸分析可知，各試驗因子對響應值的影響不是簡單的線性關系，經回歸擬合后，得到各因素與綜合值之間的多元二次回歸方程。

Y=328-021X1-0009X2-016X3-021X4-011X1X2+0018X1X3-011X1X4-016X2X3-0085X2X4-021X3X4-031X12-070X22-031X32-040X42

221回歸模型方差分析由表3可知，響應值Y（得率）回歸模型高度顯著（P<00001），一次項X1（料液比）、X3（提取時間）、X4（乙醇濃度）對海鮮菇副產物黃酮類化合物得率的影響差異均極顯著（P<001），X2（提取溫度）不顯著;二次項X12、X22、X32、X42對海鮮菇副產物黃酮類化合物得率的影響差異均極顯著（P<001）;交互項中只有X3X4對海鮮菇副產物黃酮類化合物得率的影響差異顯著（P<005），其他交互項均不顯著。4個因素對海鮮菇副產物黃酮類化合物得率的影響主次順序為：X4（乙醇濃度）>X1（料液比）>X3（提取時間）>X2（提取溫度）。

對二次回歸方程進行F檢驗和失擬性檢驗，結果表明：模型P<00001，說明模型極顯著;失擬項P=00564>005，說明模型擬合程度好，可用此模型進行分析和預測。

222因素交互作用對海鮮菇副產物黃酮類化合物得率的影響由圖5可知，乙醇濃度和提取時間的交互作用對海鮮菇副產物黃酮類化合物得率的影響差異顯著，隨著乙醇濃度的升高和提取時間的延長，海鮮菇副產物黃酮類化合物得率呈先升高后降低的趨勢，即在一定的乙醇濃度和提取時間條件下海鮮菇副產物黃酮類化合物得率具有極大值。海鮮菇副產物黃酮類化合物得率隨乙醇濃度的變化幅度大于提取時間，表明乙醇濃度對得率的影響更為顯著，這與上述單因素試驗及方差分析的結果一致。

223海鮮菇副產物黃酮類化合物提取的工藝參數優化與模型驗證由回歸方程預測可得因素水平的最優組合，并將各因素水平換算為對應的實測值，得到海鮮菇副產物黃酮類化合物提取的最佳工藝參數為：料液比1∶284、提取溫度5057℃、提取時間138 h和乙醇濃度5842%，在該條件下海鮮菇副產物黃酮類化合物得率為340 mg·g-1。考慮到實際操作可行性，將最佳工藝參數修正為：料液比1∶28、提取溫度50℃、提取時間14 h和乙醇濃度58%。根據修正的最佳工藝條件，進行6次重復驗證試驗，測得海鮮菇副產物黃酮類化合物得率的均值為341 mg·g-1，與預測值基本接近，說明該方程與實際情況擬合很好，驗證了該模型的可靠性，同時表明響應曲面法適用于海鮮菇副產物黃酮類化合物提取的工藝優化。

3結論

（1）利用響應面分析法建立了海鮮菇副產物黃酮類化合物乙醇振蕩提取過程中提取溫度、乙醇濃度、料液比、提取時間4個影響因素的回歸模型，并對模型進行分析檢驗，試驗結果表明響應面法優化海鮮菇副產物黃酮類化合物乙醇振蕩提取工藝可行。

（2）通過響應面分析得出海鮮菇副產物黃酮類化合物最佳提取工藝條件為料液比1∶28、提取溫度50℃、提取時間14 h、乙醇濃度58%、振蕩速率120 r·min-1，在此工藝條件下黃酮類化合物得率為341 mg·g-1。

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（責任編輯：柯文輝）

賴譜富，李怡彬，翁敏劼，等響應面優化海鮮菇副產物黃酮類化合物提取工藝＼[J＼]福建農業科技，2021，51（2）：01-06.

優秀學者論壇

賴譜富，1983年生，副研究員，主要從事農產品保鮮加工及功能營養食品開發研究，主持國家公益類行業（農業）科研專項、國家標準制訂、福建省科技計劃、福建省現代農業產業技術體系等項目23項，獲福建省科學技術獎二等獎2項（排名第3、4）、三等獎5項（排名第1、2、4各1項，2項排名第3），授權國家發明專利24項，發表學術論文53篇，其中6篇獲中國農學會優秀論文、福建省自然科學優秀學術論文獎。現任福建省農業科學院農業工程技術研究所副所長、福建省現代農業食用菌產業技術體系加工崗位專家、福建省農業科學院創新團隊首席專家，入選福建省首屆青年托舉人才工程、福建省農業科學院青年科技英才百人計劃等。

收稿日期：2021-01-25

作者簡介：賴譜富，男，1983年生，副研究員，主要從事農產品保鮮與加工研究。

*通信作者：陳君琛，男，1959年生，研究員，主要從事農產品加工及功能營養研究（Email：junchencc@sinacom）。

基金項目：國家重點研發計劃項目（2018YFD0400203）;福建省科技計劃項目——省屬公益類科研院所基本科研專項（2019R1032-10）;福建省現代食用菌產業技術體系建設項目（閩財指〔2019〕897號）;福建省財政專項——福建省農業科學院科技創新團隊建設項目（STIT2017-3-5）。響應面優化海鮮菇副產物黃酮類