參麥注射液對高血壓心衰大鼠糞便代謝組學的影響*

鐘森杰，李 靜，邱 宏，程 彬，胡志希，李 琳

(湖南中醫藥大學中醫診斷研究所，長沙 410208)

參麥注射液是治療心腦血管疾病的常用中藥制劑，其主要成分為紅參和麥冬的提取液。本課題組前期研究結果表明，參麥注射液對高血壓心衰大鼠的療效顯著，能有效改善動物模型的心功能指標及心肌細胞結構，表現出多靶點的作用特點[1-2]。糞便代謝產物是腸道菌群和宿主共同代謝的結果，多項研究發現，腸道菌群及其代謝產物與高血壓、心衰等心血管疾病有著廣泛聯系，使得從糞便代謝產物中篩選生物標志物用于心血管疾病的診斷、生物靶向治療、預后監測等成為可能[3-5]。本研究緊扣前沿熱點，運用液相色譜-質譜聯用(liquid chromatography mass spectrometry,LC-MS)的非靶向代謝組學技術，研究參麥注射液對高血壓心衰模型糞便代謝組學的影響，從生物學角度進一步闡明疾病的生物學基礎及藥物的干預機理。

1 材料

1.1 動物

雄性6周齡Dahl鹽敏感大鼠20只，體質量(220±10)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號SCXK(京)2016-0006，飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心SPF級實驗室。本實驗已通過湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查(倫理學批號20170906)。

1.2 主要儀器

ACQUITY型液相色譜儀、Xevo G2-XS QTof型質譜儀(沃特世科技(上海)有限公司)；JXFSTPRP-24/32型樣品研磨儀(上海凈信實業發展有限公司)；CODA型型智能大鼠血壓計(美國Kent Scientific公司)；SB-5200DT型超聲波清洗機(寧波新芝生物科技有限公司)；TYXH-I型漩渦振蕩器(上海汗諾儀器公司)；SonoScape-S2N型實驗動物彩超儀(深圳開立科技公司)；TGL-16MS型低溫離心機(上海盧湘儀儀器有限公司)。

1.3 主要試劑與藥物

本研究所用試劑由上海鹿明生物科技有限公司提供，具體批號及產家信息如下：L-2-氯苯丙氨酸(批號103616-89-3,上海恒創生物科技公司)；甲醇(批號CAEQ-4-003302-4000)、甲酸(批號CAEQ-4-00303-0050)、乙腈(批號CAEQ-4-00306-4000，均為上海安譜實驗科技有限公司)。參麥注射液(規格：20 mL/瓶，批準文號：國藥準字Z53021720，批號20190801，云南植物藥業有限公司)。

2 方法

2.1 模型制備

所用造模方法參考本課題組的前期報道[1-2]。所有大鼠給予普通飼料(0.3%NaCl濃度)適應喂養7 d后，按隨機數字表法分為正常組(6只)、模型組(7只)和參麥注射液組(7只)。正常組繼續給予普通飼料飼養，模型組、參麥注射液組給予高鹽飼料(8%NaCl濃度)，每只每天飼料20 g，飲水量不限，共20周。飼養期間每2周檢測1次鼠尾血壓，以收縮壓高于140 mmHg為高血壓病的成模判定依據。飼養結束后對3組大鼠進行超聲心動圖檢查及血清NT-proBNP含量檢測，以左室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)與左室短軸縮短率(fraction shortening,FS)顯著降低、NT-proBNP值顯著上升為心衰模型的判定依據。

2.2 分組給藥

造模結束后對參麥注射液組大鼠進行藥物干預。依據人與實驗動物的等效劑量換算，藥物的單次給藥劑量為6.0 mL/kg，腹腔注射每天1次共15 d。模型組注射同等劑量的滅菌注射用水。給藥結束后，對參麥注射液組和模型組大鼠進行超聲心動圖檢查及血清NT-proBNP含量檢測以觀察療效。

2.3 糞便樣本預處理

給藥結束后，運用糞便收集管收集各組大鼠的糞便樣本，保存于-80 ℃冰箱。上機檢測前對糞便樣本進行預處理，步驟如下：(1)取60 mg樣本，添加內標(L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg/mL；C-17，0.01 mg/mL)各20 μL和600 μL的甲醇∶水(V∶V=4∶1)；(2)加入2個小鋼珠，-20 ℃靜置2 min，加入研磨機中研磨(60 Hz，2min)；(3)超聲提取10 min，-20 ℃靜置30 min；(4)4℃12000 r/min離心10 min，取200 μL上清液，利用有機相針孔過濾器進行過濾，移至進樣瓶進行LC-MS上機檢測。

2.4 LC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱條件為ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7um)，柱溫維持在45 ℃；流動相：A-水、B-乙腈(均含0.1%甲酸)；流速保持0.4 mL/min，進樣體積5 μL。質譜條件：離子源：ESI；樣本的質譜信息收集運用正負離子掃描模式，正離子模式毛細管電壓設置為3kv，負離子模式設置為-2kv。

2.5 數據預處理

經LC-MS分析后獲得原始數據，運用Progenesis QI v2.3程序對原始數據進行處理，包括基線過濾、峰識別與對齊、保留時間校正等。將正負離子數據合并，得到包括保留時間、離子模式和質核比等信息的數據矩陣用以后續分析。代謝物的鑒定基于精確質量數、二級碎片以及同位素分布，使用 HMDB數據庫(The Human Metabolome Database)、Lipidmaps(v2.3)以及Metlin數據庫(http://metlin.scripps.edu)進行代謝物的鑒定分析。

2.6 統計學方法

將數據矩陣導入SIMCA14.0軟件進行主成分分析(principle component analysis,PCA)、偏最小二乘判別分析(partial least square discriminant analysis,PLS-DA)，獲得對應的得分圖以區分各組間代謝輪廓的總體差異。差異代謝物的鑒定采用正交-偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least square discriminant analysis,OPLS-DA)，以OPLS-DA模型的變量重要性值(variable important in projection,VIP)大于1.2為條件，挖掘具有較強解釋能力的差異代謝物，并結合SPSS 22.0統計軟件的t檢驗結果，以驗證組間差異代謝物是否具有顯著性。組間比較方式：模型組vs正常組、參麥注射液組vs模型組，選擇2組比較方式的共同差異變量。

3 結果

3.1 各組大鼠療效觀察結果

喂養20周后，模型組和參麥注射液組14只大鼠均成高血壓心衰模型，可用于后續藥物干預研究。經參麥注射液干預15 d后，與模型組比較參麥注射液組大鼠的LVEF值和FS值明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；NT-proBNP值明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)(見圖1)。

與模型組比較：**P<0.01圖1 藥物干預后大鼠LVEF、FS和NT-proBNP比較

3.2 各組大鼠基峰圖結果

LC-MS上機分析后將每個時間點質譜圖中最強的離子強度連續描繪并繪制基峰圖(base peak chromatogram，BPC)。圖2示，在正負離子模式下，3組大鼠的BPC。

圖2 正常組、模型組和參麥注射液組基峰圖(BPC)

3.3 各組大鼠PCA和PLS-DA分析結果

PCA得分圖可直觀觀察樣本間的總體分布趨勢，判斷可能存在的離散點；PLS-DA得分圖可直觀觀察樣本的分類效果和聚集程度。圖3示，正常組、模型組和參麥注射液組所有樣本點均位于95%置信區間內，3組在空間分布上完全分開且無交叉和重疊，分離程度好；圖4示，PLS-DA得分圖所有樣本點均位于95%置信區間內，3組的樣本點相互分開且互不重疊，組內聚集效果好，組間分離趨勢明顯，分類效果顯著。

注：EK為空白組(綠點)，EM為模型組(藍點)，ES為參麥注射液組(紅點)圖3 正常組、模型組和參麥注射液組大鼠偏最小二乘判別分析(PCA)得分圖

注：EK為空白組(綠點)，EM為模型組(藍點)，ES為參麥注射液組(紅點)圖4 正常組、模型組和參麥注射液組大鼠偏最小二乘判別分析(PCA)得分圖

3.4 各組大鼠差異代謝物篩選結果

為探求對分組貢獻較大的變量，以OPLS-DA模型中的分類重要性值VIP為篩選條件，鑒定出各組間有顯著差異的代謝物。以模型組大鼠出現紊亂的代謝物作為潛在藥物靶點，觀察參麥注射液干預后的代謝物變化情況。表1示，與模型組比較，參麥注射液組中神經氨酸、別石膽酸、丙氨酰色氨酸、3,9-十六碳二烯酸、N-棕櫚酰酪氨酸、亞油基肉堿、3-羥基-順式-5-十四碳酰肉堿等7種代謝物表達水平顯著回調(P<0.05)，谷氨酸、牛磺脫氧膽酸、糞甾烷酸、二十二碳六烯酸等4種代謝物表達水平呈回調趨勢。

4 討論

衰竭心臟的主要代謝特征在于產能底物利用的轉變，即由脂肪酸供能向糖類、氨基酸、酮體等物質供能轉變，此時氨基酸成為心臟產能的替代底物，故可見模型大鼠出現谷氨酸等氨基酸類物質水平紊亂[6-7]。氨基酸是構成蛋白質的基本單位，氨基酸的異常直接影響蛋白質的合成，同時心臟結構與功能的損傷亦可擾動蛋白質代謝，體現為蛋白質水解的多肽類中間產物丙氨酰色氨酸水平紊亂。產能底物轉移是心衰發生發展的病理環節，但長期的底物轉移難以為心臟供給充足的能量，因此產能底物正常化成為治療關鍵[8]。本次研究結果表明，高血壓心衰病理過程中伴隨著氨基酸及其衍生產物的水平改變，參麥注射液可促使上述物質水平趨于正常化，從而優化衰竭心臟的能量供應。

肉堿是促進脂肪酸氧化成能量的關鍵物質，其廣泛存在于生物體內，其中心肌細胞線粒體較為豐富。細胞骨架影響著線粒體的結構，心肌結構改變可損傷細胞骨架，同時心衰時的多方面病理性因素都可引發線粒體的功能障礙[9]。線粒體損傷是衰竭心臟能量代謝障礙的核心，結構與功能改變必然導致模型大鼠的亞油基肉堿、3-羥基-順式-5-十四碳酰肉堿表達異常，致使能量合成途徑受抑制。隨著參麥注射液干預作用顯現，線粒體結構與功能逐步改善，心肌能量合成得以恢復，肉堿類物質水平回調。

前期運用氣相色譜-質譜聯用技術發現，高血壓心衰大鼠血液中的膽固醇水平上升[10]。膽固醇在肝細胞中可合成膽酸、鵝脫氧膽酸和次級膽汁酸等物質，經腸道微生物分解后生成少量石膽酸和脫氧膽酸，其與膽汁酸代謝存在密切關聯[11]。膽汁酸歸屬“腸-肝循環”系統，可于腸道中轉運脂類，膽汁酸的形成是促進血液中膽固醇清除的重要途徑。體內膽固醇堆積過多，肝細胞功能受損，引發膽汁酸“腸-肝循環”障礙，因此可見模型大鼠糞便中的別石膽酸、牛磺脫氧膽酸、糞甾烷酸水平紊亂。經參麥注射液干預后，經由糞便排出的膽汁酸類物質表達回調，提示藥物通過調控膽汁酸代謝以清除體內過多的膽固醇，調節脂質堆積。

表1 組間差異代謝物篩選結果比較

3,9-十六碳二烯酸、二十二碳六烯酸均屬于不飽和脂肪酸，異常的不飽和脂肪酸代謝是眾多心血管疾病的潛在生物標志物[12-13]。由腸道微生物代謝生成的脂肪酸可經由G蛋白偶聯受體進入體內，從而參與生物體的脂代謝紊亂過程。參麥注射液通過回調不飽和脂肪酸的異常表達，可促使膽固醇酯化，降低血液中膽固醇和甘油三脂含量，繼而發揮對心臟等靶器官的保護效應[14]。

神經氨酸是丙酮酸和N-乙酰氨基甘露糖的醇醛縮合產物，一般不以游離形式存在，該物質在心衰模型中的異常表達機制仍有待進一步探討。值得注意的是，肉堿類、3,9-十六碳二烯酸、二十二碳六烯酸等物質主要來源于膳食補充，如二十二碳六烯酸在生物體內雖可經α-亞麻酸代謝生成，但生成量甚少，難以滿足機體需求。結合前文的膽汁酸“腸-肝循環”障礙，這部分紊亂的物質提示模型存在腸道穩態失衡，而對腸道功能的調節可能是參麥注射液治療高血壓心衰的有效靶點，其具體機制有待更為深入的研究。

本研究以糞便代謝組學為切入點，發現參麥注射液通過調控氨基酸及其衍生產物、肉堿類物質水平以優化能量代謝，這將有助于改善心功能，延緩心衰進展，與前期結果存在共性[15-16]；另一方面可通過調節膽汁酸代謝、不飽和脂肪酸代謝以改善體內的脂代謝紊亂。綜上所述，參麥注射液干預高血壓心衰的機制涉及優化氨基酸代謝、蛋白質代謝、肉堿代謝、膽汁酸代謝、脂質代謝等多個層面，在后續研究中可結合腸道微生態及靶向代謝組學等研究方法，深入闡明心衰與腸道微生態之間的聯系，以期獲得更為豐富的結果。