抗纖益心方對擴張型心肌病大鼠心肌纖維化相關蛋白表達的影響*

王振濤，邊汝濤，楊鳳鳴，劉嫄淑，吳 鴻

(1. 河南省中醫院，鄭州 450003； 2. 河南中醫藥大學，鄭州 450046)

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一類以單側或雙側心室擴大并伴有收縮功能障礙為主要特征的心肌疾病，我國發病率約13～84/10萬，5年病死率約為42.24%[1]。DCM的主要病理變化為心室重構，而心肌纖維化是心室重構的重要病理變化，故抑制心肌纖維化是治療DCM的一個重要方向[2]。心肌成纖維細胞的增殖、轉分化在心肌纖維化中具有重要地位[3]，在轉分化的心肌成纖維細胞內可進一步激活α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、I型膠原蛋白(Collagen I，CoI-1)等心肌纖維化相關因子，從而導致心肌纖維化的發生發展[4]，而心房利鈉肽(atrialnatriureticpeptide，ANP)、B型利鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)是心功能變化的重要指標。

抗纖益心方是臨床治療擴張型心肌病的有效方劑[5]。前期基礎研究發現，抗纖益心方具有改善DCM模型大鼠心室重構的作用[6-7]，但其對心肌纖維化的作用機制研究仍未明確。本研究通過DCM大鼠模型探討抗纖益心方抑制心肌纖維化的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級Wister雄性大鼠100只，出生后4周，體質量(52.31±5.65)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SYXK(豫)-2016-0006)。所有大鼠均飼養于河南中醫藥大學第二附屬醫院中心實驗室SPF級動物實驗中心，室溫在(22±3)℃，濕度控制在(45±5)%，12 h光暗循環。本研究由河南中醫藥大學第二附屬醫院倫理委員會批準，本單位倫理學批件無批號。

1.2 藥物

抗纖益心方藥物組成：紅參12 g，黃芪30 g，茯苓15 g，白術15 g，丹參15 g，升麻9 g，麥冬12 g，澤蘭15 g，益母草15 g。以上配方顆粒購自四川新綠色科技發展有限公司，藥物質量采用 GMP 認證(證書編號SC20150037)。將1劑中藥配方顆粒溶于煮沸的20 mL生理鹽水中充分攪拌均勻，再用微波爐煮沸2次，使藥物完全溶解即為中藥原液，其濃度為0.57 g/ml,保存于4 ℃備用。卡托普利片購自上海上藥信誼藥廠有限公司(批號63170904)， 25 mg/片；呋喃唑酮片購自天津力生制藥股份有限公司(批號12020160)，100 mg/片。

1.3 主要試劑

Masson三色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號G1340)；α-SMA、CoI-1抗體(武漢三鷹生物技術有限公司，貨號14395-AP、14695-1-AP)；CTGF抗體(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號E-AB-12339)；GAPDH(武漢博士德生物技術有限公司，貨號BM3876)；辣根過氧化物標記羊抗免疫球蛋白、辣根過氧化物標記羊抗鼠免疫球蛋白(武漢塞維爾生物科技有限公司，貨號GB23204、GB23301)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(西安晶彩生物科技有限公司，貨號JC-PE001)；PVDF膜(美國Millipore公司，貨號IPHV0010)；RNA提取試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司，貨號B518651)；cDNA逆轉錄試劑盒(Takara Bio，貨號6210 A)；熒光定量試劑盒(Takara Bio，貨號RR430 A)。

1.4 主要儀器

小動物超聲儀(德國西門子股份公司，型號：Acuson Cypress)，石蠟切片機(湖北慧達儀器公司，型號：HD-325)；組織包埋機(湖北慧達儀器公司，型號：HD-310)；凝膠電泳儀(美國伯樂，型號：164-5070)、光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司，型號：CKX41)；攝影顯微鏡(德國萊卡公司，型號：ICES-003)；CFX96實時熒光定量PCR儀(美國伯樂，型號：185-2148)。

2 方法

2.1 DCM大鼠模型建立

100只大鼠適應性喂養1周后隨機分為造模組90只和正常組10只，按照文獻[8]和前期研究方法復制DCM大鼠模型，在造模組大鼠飲用水中加呋喃唑酮(按1 kg去離子水加700 mg呋喃唑酮)喂養。造模組大鼠連續10周自由飲用呋喃唑酮水溶液，正常組大鼠同期自由飲用去離子水，造模期間造模組及正常組均無死亡。10周后對造模大鼠進行心臟超聲心動圖檢查，造模成功大鼠室壁運動符合DCM影像學改變，且射血分數與正常組有明顯統計學差異。

2.2 分組及給藥

將造模成功大鼠隨機分為模型組、抗纖益心方高劑量組、抗纖益心方中劑量組、抗纖益心方低劑量組和卡托普利組5組各10只。根據《藥理實驗方法學》提供的計算方法，抗纖益心方高劑量組灌胃量為18.8 g/(kg·d)、中劑量組9.4 g/(kg·d)、低劑量組4.7 g/(kg·d)，卡托普利組灌胃10.125 mg/(kg·d)，正常組、模型組灌服等量的生理鹽水[9]。同時模型組、抗纖益心方各治療組及卡托普利組大鼠繼續自由飲用呋喃唑酮水溶液，以保證致病因素的持續存在。

2.3 取材

藥物干預4周后，用4%水合氯醛對大鼠進行腹腔注射麻醉，檢測各組大鼠心臟超聲射血分數(ejection fraction，EF)、左室短軸縮短率(fractional shortening，FS)等相關指標后處死動物，開胸迅速取出心臟。部分大鼠心肌組織用PBS洗滌殘留血液后，用組織剪剪切成 1 cm3左右的小塊，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中備用。另取部分大鼠心肌組織在預冷的生理鹽水中沖洗殘留的血液成分，然后用4%多聚甲醛溶液固定，24 h后進行組織脫水、包埋、切片。

2.4 Masson染色觀察大鼠心肌纖維化情況

組織切片后脫蠟至水，依次用蘇木素染色、分化、返藍、麗春紅品染色、苯胺藍染色、脫水、二甲苯透明，中性樹脂膠封片。在顯微鏡下觀察各組切片染色情況，肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍色，隨機選取5個視野留取圖像進行分析。

2.5 Real-time PCR法檢測大鼠心肌組織ANP、BNP、CTGF、α-SMA mRNA的表達

表1示，取各組大鼠心肌組織50 mg加入到Buffer Rlysis-AG溶液中，勻漿后靜置5 min，12000 r/min離心5 min，離心2次，取上清加入1/2體積的無水乙醇，混勻后加入到組織柱式RNA提取柱中，按照操作步驟依次加入GT Solution、NT Solution等溶液，提取總RNA溶液，測定總RNA濃度及純度后逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板行Real-time PCR檢測，以正常組為參照組，β-actin為內參，用2-ΔΔCt表示mRNA的相對表達，計算各組的表達量。ANP、BNP、α-SMA、CTGF、β-actin引物由上海生工合成。

表1 ANP、BNP、α-SMA、CTGF、β-actin引物合成序列

2.6 Weston blot法檢測大鼠心肌組織CTGF、α-SMA、CoI-1的表達 取各組大鼠心肌組織30 mg加入200 μL RIPA裂解液中，冰上裂解1 h，4 ℃ 12000 r/min離心10 min，取上清即為總蛋白液。BCA法檢測蛋白濃度，100 ℃金屬浴10 min，冰上靜置10 min，4 ℃ 12000 r/min離心5 min，上清即為上樣液。在SDS-PAGE膠中電泳，電泳結束后轉印至PVDF膜上，轉印結束后取出膜在5%脫脂牛奶中封閉1 h。用5%脫脂牛奶配制孵育抗體：CTGF(1∶1000)、α-SMA(1∶1500)、CoI-1(1∶2000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5次，每次5 min，洗膜結束后用二抗孵育1.5 h，TBST洗膜5次，每次5 min。將條帶放入ELC顯影液，用凝膠圖像處理系統分析條帶灰度值，用目的蛋白灰度值與內參蛋白灰度值的比值表示蛋白相對表達量。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 正常組與模型組大鼠心臟超聲檢測結果

表2示，造模10周后超聲心動圖檢測造模大鼠與正常組心功能，結果發現造模成功大鼠心室壁運動幅度降低，舒張末內徑(Left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)及收縮末內徑(Left ventricular end systolic diameter，LVESD)較正常組擴大(P<0.05或P<0.01)，EF降低(P<0.01)，造模成功大鼠共計50只。

表2 模型組與正常組大鼠心臟超聲情況

3.2 抗纖益心方對DCM模型大鼠心功能影響

表3示，與正常組比較，模型組大鼠EF、FS下降(P<0.01)；與模型組比較，抗纖益心方各組及卡托普利組大鼠給予藥物干預4周，EF、FS較模型組均有明顯升高(P<0.05或P<0.01)，且升高程度與抗纖益心方濃度增加具有明顯的量效關系。

表3 抗纖益心方對DCM模型大鼠心臟超聲指標EF、FS的影響

3.3 抗纖益心方對DCM模型大鼠心肌組織纖維化的影響

圖1示，在400倍光鏡下，正常組大鼠心肌組織僅見少量的心肌膠原纖維。與正常組比較，模型組心肌組織可見大量藍色心肌膠原纖維增生，心肌纖維化程度顯著加重。與模型組比較，抗纖益心方高、中劑量組及卡托普利組可見藍色心肌膠原纖維明顯減少，而低劑量組仍可見大量心肌膠原纖維增生。

注：1.正常組；2.模型組；3.高劑量組；4.中劑量組；5.低劑量組；6.卡托普利組圖1 各組大鼠心肌組織心肌膠原纖維化Masson染色(400×)

3.4 各組大鼠心肌組織ANP、BNP、α-SMA、CTGF mRNA表達水平

表4示，與正常組比較，模型組ANP、BNP、α-SMA、CTGF mRNA表達水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，抗纖益心方高、中劑量組及卡托普利組都有不同程度的降低(P<0.01)，而抗纖益心方低劑量組α-SMA、CTGF mRNA表達水平降低不明顯(P>0.05)。

表4 各組大鼠心肌組織ANP、BNP、α-SMA、CTGF mRNA表達水平比較

3.5 各組大鼠心肌組織CTGF、α-SMA、CoI-1蛋白表達水平

圖2表5示，與正常組比較，模型組α-SMA、CTGF、CoI-1表達水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，抗纖益心方高、中劑量組及卡托普利組表達水平都有明顯降低(P<0.05或P<0.01)，而低劑量組降低不明顯(P>0.05)。

表5 抗纖益心方對CTGF、α-SMA、CoI-1蛋白表達水平影響比較

圖2 抗纖益心方對CTGF、α-SMA、CoI-1蛋白表達水平的影響

4 討論

臨床實踐表明，中醫藥在擴張型心肌病治療中具有良好的療效。中醫認為本病基本病機為本虛標實，心氣虧虛為基礎，心陽不振為后期之根本，血瘀、水濕為病理產物，是疾病發展及加重的重要因素，其病位在心，常累及肺、脾、肝、腎等臟腑，故臨床治療多采用益氣、活血、利水等措施[10]。王振濤根據本病的病因病機自擬具有益氣活血作用的中藥復方抗纖益心方。抗纖益心方在升陷湯及補中益氣湯的基礎上化裁而來，重用黃芪為君藥以補氣，紅參既可補脾胃之氣又可補元氣、肺氣，白術有燥濕健脾之功效，從而使氣血生化有源；針對本病瘀血水濕停留等實邪，加入丹參、茯苓、益母草、澤蘭等以化瘀利水，諸藥合用使氣血生化有源，瘀血、水濕得化，從而有效治療擴張型心肌病。

心肌纖維化在病理形態上主要表現為膠原沉積，各型膠原比例失調，尤其是Ⅰ型、Ⅲ型膠原的比例升高、排列紊亂，同時伴有心肌成纖維細胞的增生[11]。心肌成纖維細胞是調節細胞外基質合成與降解的主要細胞[12]。血管緊張素Ⅱ、醛固酮、內皮素等刺激因子可促進心肌成纖維細胞的增殖及轉分化為肌成纖維細胞，肌成纖維細胞合成分泌膠原蛋白的能力遠大于成纖維細胞，是膠原蛋白合成的主要來源細胞[13]。α-SMA是國際認可的肌成纖維細胞活化的標志性蛋白，肌成纖維細胞可大量合成I、III型膠原蛋白，從而導致膠原代謝異常[14]。CTGF是一種促成纖維細胞分裂和膠原沉積的細胞因子，可介導血管緊張素Ⅱ、TGF-β的部分生物效應[15]，從而刺激心肌成纖維細胞增殖和細胞外膠原的沉積，在促進組織纖維化方面起到重要作用。

本次研究結果顯示，抗纖益心方具有改善DCM模型大鼠心功能的作用，與前期實驗結果一致[6]。抗纖益心方高、中劑量組及卡托普利組可明顯改善大鼠心臟超聲EF、FS值，而低劑量組改善不明顯。抗纖益心方各組及卡托普利組可明顯降低DCM模型大鼠心肌組織中ANP、BNP、α-SMA、CTGF mRNA表達水平，且抗纖益心方高、中劑量組及卡托普利組可顯著降低DCM模型大鼠心肌組織中α-SMA、CTGF、CoI-1蛋白表達水平，而低劑量改善不明顯。綜上所述，抗纖益心方可能通過抑制心肌成纖維細胞的增殖、轉分化，從而抑制DCM模型大鼠心肌纖維化的發展，但其作用途徑仍需今后進一步的深入研究。