胚胎發育動力學參數對囊胚移植周期妊娠結局的影響及預測模型建立

史艷彬 張婉妮 邵小光

大連市婦女兒童醫療中心生殖與遺傳醫學中心，遼寧大連 116000

盡管輔助生殖技術取得了重大進展，但體外受精-胚胎移植（in vitro fertility-embryo transfer，IVF-ET）面臨的主要挑戰仍然是選擇最佳的單胚移植技術[1]。增強胚胎選擇過程將使體外受精成功率最大化[2]。大量文獻報道，在侵入性技術PGT-A 局限性的背景下，Time-lapse 技術作為以選擇具有最高發展潛力的胚胎為目標來優化非侵入性技術方面展示了極大的優勢[3-5]。本研究通過回顧性分析胚胎發育動力學指標與妊娠結局的關系，建立胚胎動力學指標預測囊胚移植后妊娠結局的模型，為臨床工作提供理論基礎，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年7月～2019年7月于大連市婦女兒童醫療中心生殖與遺傳醫學中心使用Time-lapse 囊胚培養并行囊胚移植的704個周期的資料，排除合并影響妊娠結局要素和移植兩枚囊胚僅單胎妊娠的453個周期，共納入251個周期的371個胚胎。根據妊娠結局，將其分為未妊娠組（A組，N=115個周期，n=169個胚胎）和臨床妊娠組（B組，N=136個周期，n=202個胚胎）。本研究經過大連市婦女兒童醫療中心醫學倫理委員會審核批準。

納入標準：①年齡≤40歲；②不孕原因為女方輸卵管因素、排卵障礙和男性精液因素；③夫妻未見染色體異常。排除標準：①補救顯微受精；②移植日子宮內膜＜7 mm；③移植2 枚囊胚單胎妊娠；④宮腔因素（如息肉、粘連或黏膜下肌瘤）；⑤患有肥胖、生殖器畸形、高泌乳素血癥、子宮內膜異位癥、卵巢早衰、免疫性疾?。虎藁加懈哐獕?、糖尿病、腎病等內科合并癥者。

1.2 方法

控制性超促排卵按大連市婦女兒童醫療中心常規進行（長方案或拮抗劑方案）。行體外受精-短時受精未補救患者的受精卵置于37℃、6% CO2、5% O2的Time-lapse 培養箱中（ESCO，Miri-TL），用一步培養液（GlobleRtotalRLP，美國）進行全程培養；分別于取卵后第5、6 天觀察囊胚并評價（評價標準采取Gardner評分系統）。依據形態學指標選擇三級或四級囊胚移植（CC 囊胚不用于移植）。

新鮮周期或凍融周期（HRT 方案）囊胚移植，移植時內膜厚度≥7 mm。囊胚移植12 d后檢測血人絨毛膜促性腺激素（β-HCG）判斷妊娠。如妊娠，胚胎移植后28～35 d B超檢查，確定臨床妊娠及妊娠胎數。妊娠后繼續使用雌孕激素維持妊娠，孕8～9 周可開始逐漸減量，孕12～14 周停藥。

1.3 觀察指標

觀察胚胎發育動力學指標對妊娠結局的影響，探索影響囊胚移植周期臨床妊娠結局的胚胎發育動力學指標，建立臨床妊娠結局預測模型，并對其進行驗證。

以雌雄原核消失的時間點為t0；t2、t3、t4、t5、t8：合子分裂為2細胞、3細胞、4細胞、5細胞、8 細胞的時間點；cc2：t3～t2；cc3：t5～t3；s2：t4～t3；s3：t8～t5；tM：桑椹胚形成的時間；tSB：囊胚開始形成的時間點；tB：囊胚完全形成的時間點。由一名胚胎師評估胚胎發育動力學指標。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。二元Logistic 回歸分析把對妊娠結局有顯著影響的胚胎動力學指標作為自變量，妊娠情況作為因變量，使用逐步回歸法統計，以P≤0.05 為選入變量的標準，P≥0.10 為剔除變量的標準。采用Enter 法，建立體外受精囊胚移植臨床妊娠率預測方程式，并通過接受者操作特征（ROC）曲線檢驗方程的有效性。

2 結果

2.1 兩組胚胎發育動力學指標的比較

兩組的t2、t3、t4、cc2、cc3、s2 比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；兩組的t5、t8、s3、tM、tSB、tB 比較，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 兩組胚胎發育動力學指標的比較（h，）

表1 兩組胚胎發育動力學指標的比較（h，）

組別 周期數 t2 t3 t4 t5 t8 cc2 A組B組115 136 t值P值2.76±1.36 2.15±0.39 0.181 0.158 14.43±2.98 12.61±0.67 0.174 0.238 15.70±4.30 13.05±0.65 0.197 0.153 28.61±4.32 23.86±1.46 3.076 0.044 33.80±5.33 27.89±5.01 4.213 0.027 11.89±1.95 10.45±0.94 0.179 0.224組別 周期數 cc3 s2 s3 tM tSB tB A組B組t值P值115 136 14.37±1.93 11.58±1.38 2.167 0.080 1.25±2.96 0.39±0.24 0.119 0.500 5.05±3.29 1.41±0.55 5.935 0.010 78.84±5.32 66.48±6.56 10.179 0.000 87.48±5.99 74.16±5.82 6.373 0.000 105.21±5.50 86.39±6.16 8.154 0.000

2.2 建立臨床妊娠結局相關動力學指標影響因素的預測模型

以妊娠結局為因變量（未妊娠=1，持續妊娠=2），以兩組比較后差異有統計學意義的胚胎發育動力學指標（t5、t8、s3、tM、tSB、tB）為自變量，建立妊娠結局相關胚胎發育動力學指標的預測模型，根據表2中數據可得體外受精囊胚移植后妊娠結局相關胚胎發育動力學指標的預測模型：P=1/（1+y），y=-3.803+0.007×t5-0.004×t8-0.042×s3+0.023×tM+0.005×tSB+0.043×tB。

表2 臨床妊娠結局相關動力學指標影響因素的回歸模型

2.3 預測模型的敏感度和特異性

根據所得臨床妊娠結局回歸模型，計算臨床妊娠率預測概率，并與實際妊娠結局數據繪制ROC曲線（圖1），結果顯示，曲線下面積為0.702 （95%CI：0.679～0.791，P=0.047），對應的敏感度為84.8%，特異性為88.9%，總正確率為86.70%。提示妊娠結局相關胚胎發育動力學指標的預測模型——y=-3.803+0.007×t5-0.004×t8-0.042×s3+0.023×tM+0.005×tSB+0.043×tB 有臨床應用價值。

圖1 預測模型的敏感度和特異性

3 討論

人類胚胎學中的延時成像技術顯示了胚胎獨特的發育特征，通過胚胎發育事件的確切時間能夠獲得細胞周期長度和裂解模式[6]。已有文獻證明，胚胎發育的速度與著床率有關[7]。移植特定發育速度的胚胎，最終患者的妊娠結局不盡相同[8-9]。這可能是由于胚胎的發育時間影響細胞周期的合成期（S期）持續時間；此外，染色體異?？赡軙舆tDNA 復制[10]，因此改變了細胞周期和分裂的長度。對預測胚胎發育和體外受精治療結局預后因素的研究引起了學術界廣泛的關注。目前，已有基于形態動力學參數的多種胚胎選擇算法和妊娠結局的預測算法，但大多數關于動力學發育的人類胚胎研究都是基于在不同實驗條件下產生的少量樣本胚胎的生存能力與一系列嚴格調控的細胞事件有關，使用來自單個中心的數據很難被其他中心利用。此外，對于體外受精周期，卵子成熟度的不同會影響精子入卵的時間有差異，進而影響原核出現的時間。為了克服這些局限，本研究使用原核消失的時間點作為t0，利用胚胎發育的相對速度作為因變量，基于數據挖掘的模型具有較高的預測能力，可以有效地用于區分植入潛能增加的胚胎。

本研究的Logistic 回歸分析顯示，t5（OR=1.007，95%CI：1.001～1.013，P=0.000）、t8（OR=0.996，95%CI：0.941～1.054，P=0.012）、s3（OR=0.959，95%CI：0.821～1.120，P=0.000）是影響體外受精囊胚移植后妊娠結局的重要影響因素。這與Meseguer 等[11]（提出5 細胞期分裂及后期事件的發生時間是著床潛能的良好指標）以及Cruz等[12]（通過胚胎鏡觀察胚胎，提出5 細胞形成的時間和桑葚胚形成的時間是預測胚胎發展潛能更可靠的指標）的結論相一致。這些現象可能與人的胚胎從4～8 細胞階段是人胚胎基因組激活的關鍵時期有關[13]。本研究中的tM（OR=1.023，95%CI：1.005～1.041，P=0.009）、tSB（OR=1.005，95%CI：1.001～1.009，P=0.000）、tB（OR=1.044，95%CI：1.002～1.088，P=0.000）也是妊娠結局的重要影響因素。最近的延時顯微鏡觀察表明，致密化可能是人類胚胎活力的一個重要檢查點，通過其，胚胎可以感覺到并消除染色體異常的卵裂球[14]。2013年，Campbell 等[15]提出tSB和tB是具有顯著預測妊娠結局能力的指標。

綜上所述，筆者利用著床前胚胎發育動力學指標與妊娠結局的關系，提出一個回歸模型以通過胚胎發育動力學指標預測囊胚移植后是否有更高的妊娠可能：P=1/（1+y），y=-3.803+0.007×t5-0.004×t8-0.042×s3+0.023×tM+0.005×tSB+0.043×tB，并檢驗其有效性。從心理上增加醫患雙方信心，減少焦慮情緒。然而，本模型的回顧設計和模型本身所固有的偏差將使其臨床應用有待進一步開發和挖掘。