基因拷貝數變異在遺傳性耳聾研究中的進展

王秋權 黃莎莎 袁永一 康東洋 吳婕 張昕 戴樸

中國人民解放軍總醫院耳鼻咽喉頭頸外科醫學部，國家耳鼻咽喉疾病臨床醫學研究中心，聾病教育部重點實驗室，聾病防治北京市重點實驗室（北京 100853）

人類基因組上存在各種形式的遺傳變異和多態性，隨著各種基因工程技術的深入開展，單個核苷酸變異引起的多態性（Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs）的突變機制及其與遺傳性疾病的關聯性更清晰明了，但其僅能闡明人類疾病復雜遺傳因素的一小部分。越來越多證據表明，拷貝數變異（Copy Number Variations,CNVs）可能解釋其余復雜遺傳因素。作為遺傳多樣性的一種普遍形式，CNVs被認為是與參考基因組相比，基因組DNA中大小為幾十個堿基（＞50bp）到幾Mb的DNA拷貝數變異現象，包括基因組重復、缺失、倒置和易位等，其中重復和缺失是最常見的[1]。

早在1959年，Lejeune及團隊就發現人類基因組中存在長度大于5Mbp的基因變異[2]。2004年Iafrate小組和Sebat團隊分別報道人類基因組中CNVs以多態性廣泛存在，通過進一步分析發現其涉及的基因組區域包含許多參與調節細胞生長及代謝等功能的基因，且與多種出生缺陷疾病相關[3,4]。2006年,Redon團隊鑒定出涵蓋360Mbs大小，覆蓋人類基因組全長約12%，共計1447個拷貝數變異區，并發布第一代人類基因組CNVs圖譜[5]。千人基因組計劃也已發現了100萬個短插入或缺失和2萬個CNVs位點[6]，這極大程度地擴展了人類對遺傳學領域的認知。基因組變異數據庫（Database of Genomic Variants,DGV）整理并收錄了現已發現報道的CNVs數據，目前發現CNVs約983845個，所覆蓋的基因組片段占人類基因組的29%以上，遠超SNPs。CNVs突變率大約是SNPs突變率的100～10000倍[7]，對基因組遺傳變異的多樣性具有重要意義（詳見表1）。相對SNPs的概念,將人群中等位基因頻率＞1%的CNVs定義為基因組拷貝數多態（Copy Number Polymorphisms,CNPs），超過90%的CNVs屬于這一類型，而頻率＜1%的CNVs稱為罕見CNVs[8]。

表1 CNVs與SNPs的比較Table 1 CNVs versus SNPs

在臨床上常見兩類CNVs：復發性CNVs和非復發性CNVs[9]。復發性CNVs斷裂點常位于包含大量片段重復的固定區域，所以這類CNVs在不同個體中的情況基本一致，大量的不同臨床表型被證實與復發性CNVs相關。與之不同，非復發性CNVs的斷裂點處于特定序列區域，難獲取準確序列數據，且微觀同源性較低，在端點連接處具有短插入或鈍端。部分致病性及非致病性CNVs屬于此類。大多數非復發性CNVs是簡單的刪除或串聯重復，但也有一些非常復雜，表現為數十個事件聚集在單個基因組區域中[10]。

1 CNVs的突變機制

目前提出的解釋大多數CNVs形成的機制主要有四種，包括非等位基因同源重組（Nonallelic Homologous Recombination,NAHR），非同源末端連接(Non-homologous End Joining,NHEJ)，復制叉停滯和模板轉換機制(Fork Stalling and Template Switching,FoSTeS)及反轉錄轉座子驅動機制，對幾種主要機制特點及對比詳見表2。

表2 CNVs形成主要機制的特點及比較Table 2 Characteristics and comparison of the main mechanisms of CNVs formation

1.1 非等位基因同源重組

NAHR是由彼此具有高度同源性的兩個非等位基因DNA序列之間的比對和交叉引起的。據估計，大約28%的CNV可能通過NAHR形成而來[11]，是串聯重復和缺失的重要來源[12]。NAHR發生位點的分布存在重組熱點現象，即存在有順式作用基序（motif）“CCNCCNTNNCCNC”的富集[13]。NAHR可在減數分裂過程中產生帶有CNVs的配子，并可遺傳給后代[14]。

1.2 非同源末端連接機制

一些結構簡單的CNVs則可能是源自NHEJ。NHEJ是修復哺乳動物細胞DNA雙鏈斷裂(DNA Double Strand Break，DSB)的關鍵機制，當雙鏈斷裂時，如果來自不同染色體的兩個片段連接在一起，就會導致基因缺失和重復。有研究表明，56%的CNVs由NHEJ引起的。其產生的CNVs斷點更集中于重復序列內部或周圍,某些可以引起DSB或DNA彎曲的DNA基序（如TTTAAA）附近也比較容易出現CNVs。由于NHEJ發生時不需要高度同源性的DNA序列反應底物，并可能會有部分堿基插入連接處，這些使其與其他CNVs產生機制有所差異[15]。

1.3 復制叉停滯和模板轉換機制

2007年Lee通過對基因組重排的觀察，發現當DNA的復制叉停滯時，滯后鏈將會從模板上脫落，通過微同源序列轉到另一個空間位置上接近的復制叉重新開始合成DNA，從而導致拷貝數刪除或重復，而轉換和重新合成可能會連續發生多次，導致更復雜的重排，據此提出了FoSTeS模型。而新復制叉在起始復制叉的上下游決定CNVs的類型[16]。

1.4 反轉錄轉座子驅動機制

在人體中，逆轉座子可在三個方面上介導CNVs形成。首先，人類基因組中的某些逆轉錄轉座子仍然活躍，具有多態性，這些可被認為是CNVs本身[17]。其次，逆轉錄轉座機制有時會導致加工過的mRNA整合回到基因組中，可能導致基因劑量的增加[18]。最后，逆轉座子可能改變染色體結構可塑性而促進大片段CNVs的形成[19]。

2 CNVs與遺傳性耳聾的相關研究

聽力損失是臨床上最常見的致殘性疾病之一，全球約有4.66億人口因聾致殘，約占全球人口的5%，每1000個新生兒中就有2-3名耳聾或聽力障礙患者,其中大約50%-60%是由遺傳因素引起的[20,21]，作為基因組變異的一種重要表現形式，CNVs也在遺傳性耳聾的多基因遺傳研究中越來越多的被發現。

早在1998年，Laer等人在DNFA5基因座上發現了一個插入/缺失突變，這是首次報道CNVs導致非綜合征耳聾的文章[22]。2001年，Verpy等人通過候選耳聾基因方法發現STRC基因存在大片段的刪除[23]。2012年，Francey等人鑒定出17個STRC基因缺失，發現大片段CNVs是STRC基因的主要突變類型[24]。據評估，在日本散發的明確遺傳因素的中重度感音神經性聾患兒中，約1/3與STRC基因CNVs有關[25]。越來越多的研究證實CNVs是遺傳性耳聾的常見原因之一，2014年Richard研究組發表的第一篇CNVs在遺傳性耳聾的大宗病例報道，發現在明確分子病因的患者中CNVs參與致病者占18.7%，涉及16個基因的143種CNVs[26]。同年，復旦大學李華偉團隊應用二代測序技術對79名散發耳聾患者進行檢測，在27個耳聾基因中發現了CNVs[27]。

OTOA基因被認為是第二常見的受CNVs影響的耳聾基因，已有近30個在不同種族人群導致聽力損失的OTOA基因缺失CNVs被報道[28]。在綜合征型耳聾基因中也發現了大量CNVs，如覆蓋EYA1基因的18q13基因片段上發生的缺失CNVs正是腮耳腎綜合征的病因之一，EYA1基因部分外顯子的重復也可導致此綜合征的發生[29,30]。此外，至少有50個CNVs發生在USU2A基因上而導致Usher綜合征[31]。截至目前已有64個耳聾基因被報道發生CNVs。在雙側耳聾患者中，20%的致聾基因被鑒定為存在CNVs，15%接受基因檢測的患者攜帶有CNVs[32]。

3 遺傳性耳聾CNVs的致病機制

目前研究表明，人類基因組CNVs并不是隨機分布,近40%的CNVs更傾向分布于基因沙漠區，但仍有大量疾病易感基因或致病基因定位于CNVs區域，可解釋多達20%的個體異常表型[5,33]。CNVs可通過基因破壞、基因融合、劑量效應、位置效應等機制導致疾病[34]。

CNVs可直接對聽力功能所必需的蛋白質功能產生有害影響,從而導致耳聾。當CNVs累及整個基因時會導致耳聾發生，如當OTOA基因發生純合缺失時，其編碼序列缺失而無法編碼Otoancorin蛋白，使耳蝸蓋膜發生異常導致耳聾[35]；當基因調控/啟動子區發生CNVs時也會引起耳聾，POU3F4基因僅在上游增強子區域發生CNVs時便可導致內耳發育異常[36]。此外，CNVs可能會導致隱性基因暴露，如當TMPRSS3基因雜合變異時，復雜的基因組重排導致基因破壞，產生無效等位基因而導致耳聾[37]。

由于CNVs片段長度比較長，可能涵蓋數個基因，且其結構復雜，因此其也可能通過影響分子表型或基因組表型異質性，進而導致耳聾發生，所以需要更好的了解CNVs對基因表達的影響，以評估其在遺傳性耳聾復雜性狀中的作用。

CNVs導致遺傳性耳聾所涉及的具體基因及機制仍需進一步的分析和驗證。對遺傳性耳聾來說，有學者提出致病性CNVs應被定義為：1)覆蓋已知致聾基因的編碼區，臨床表型及遺傳模式與已報道的該基因表型及模式吻合；2)覆蓋已知的致病CNVs；3)新發的CNVs或在多個受累家庭成員中發現已知引起疾病的基因突變與表型共分離CNVs；4)位于一個基因富集的區域；5)具有大片段的變異，CNVs處于特異的、富含基因序列的區域；6)為稀有CNVs，在內部數據庫/公共數據庫人群攜帶率＜1%[38]。

4 CNVs的檢測方法

近年來，研究人員提出了很多與標準參照基因進行比較的CNVs檢測技術,以確定變異區域的拷貝數及斷點位置為其重點研究方向,但不同的檢測方法及其應用的計算策略在變異類型和CNVs拷貝數鑒定，及斷點位置準確度等方面各有優劣[39]。

實時熒光定量PCR（Real-time Fluorescent Quantitive Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR）是首先用于目標區域CNVs的檢測技術,其敏感性高，操作簡單，污染少，重復性好，但其不能進行高通量CNVs檢測。多重鏈接探針擴增技術（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification，MLPA）是對待檢DNA靶序列進行定性和半定量分析的檢測技術，具有通量高，靈敏度高,特異性強，可重復性好的特點，但其只能檢測已知序列，且探針的特異性要求高，無法檢測出易位、倒位等情況。染色體微陣列分析技術中常用的微陣列比較基因組雜交（Array-based Comparative Genomic Hybridization，aCGH）技術使用雙雜交策略檢測待測樣本位點的拷貝數變化，由于其可同時分析數萬個基因，因此被廣泛地應用于全基因組CNVs檢測及產前診斷CNVs檢測中，但其不能檢測到倒位、易位及低水平的嵌合體，也無法檢測斷點信息，且對單拷貝數不敏感。下一代測序（Next Generation Sequencing，NGS）技術，其具有高通量及高分辨率的特性，可對CNVs進行深度挖掘，精確定位和鑒定，除此之外其還可檢測到覆蓋全染色體非整倍體、大及更低比例的嵌合，基于NGS的CNV-seq也越來越多地應用于產前診斷中[40]。但其受限于讀長短特性，并易受覆蓋率影響，很難檢出較小的CNVs，且對斷點的精確定位仍存在困難。

目前，檢測技術都具有一定優勢及不足，僅使用一種方法還不能完全的檢測出一個個體基因組所包含的所有CNVs。測序技術正朝通量更高，讀長更長，精度更高和成本更低的方向發展，如基于納米孔測序原理的第三代測序技術(Third Generation Sequencing，TGS)，其不再需要PCR擴增過程，可對每一條DNA分子進行單獨測序，更好地解決復雜重復序列、高GC等問題。由于其長讀長的特性，可準確檢測CNVs，確定CNVs片段參考數據，更可以精確地定位CNVs的準確位置，找到確切斷點信息[41]。

5 小結及展望

人類基因組中存在大量的CNVs,遺傳效應遠大于SNPs，對CNVs的研究更有助于對基因組變異與疾病間關系的深入理解。對于CNVs和耳聾基因突變的綜合作用，尤其是在正常聽力個體中CNVs多態性的認識，我們仍處于早期階段。隨著對CNVs研究方法及檢測技術的發展，可使我們更深入了解耳聾相關致病基因CNVs的致病機制，進一步理解遺傳性耳聾的表型及遺傳變異之間的關系，為遺傳性耳聾患者群體提供更有價值的分子診斷信息，指導臨床發現新的治療方法，以及制定更好的預防策略。