斑馬魚模型評價抗真菌藥物的耳毒性

諶晶晶 徐慧芳 唐旭霞

浙江省中醫院耳鼻咽喉科（杭州 31006）

真菌性外耳道炎是真菌感染外耳道皮膚所致的炎性病變，多局限在外耳道，但也可通過穿孔的鼓膜侵及中耳或開放的乳突腔。其癥狀常表現為耳道瘙癢、溢液、耳脹及聽力下降等。最常見的致病菌是白色念珠菌和曲霉菌[1-3]。

真菌性外耳道炎的治療除清潔外耳道，保持外耳道干燥外，局部抗真菌藥物的使用也很重要。氟康唑、聯苯芐唑及制霉菌素這三種抗真菌藥在臨床工作中使用率較高。氟康唑和聯苯芐唑屬于唑類抗真菌藥，制霉菌素屬于多烯類抗真菌藥，兩者均有廣譜抗菌作用。前者通過阻斷麥角甾醇的合成而破壞真菌細胞壁的完整性，抑制真菌的生長繁殖，后者通過改變真菌細胞壁通透性發揮作用。局部用抗真菌藥劑型主要有軟膏、凝膠、乳膏和水劑。有研究顯示軟膏可能刺激中耳黏膜形成肉芽。相比其他劑型，水劑更容易到達外耳道深部，特別是在外耳道充血腫脹的情況下。因此，水劑更適合真菌性外耳道炎。但在鼓膜置管、鼓膜穿孔及實施過乳突開放術的情況下，滴耳液就有可能進入中耳，進而通過圓窗膜進入內耳，對內耳毛細胞的功能造成不同程度的影響[4-6]。因此，對抗真菌藥物耳毒性的研究非常必要。

斑馬魚為低等脊椎動物，其產卵量大，繁殖周期短，胚胎身體透明，可以在顯微鏡下觀察其給藥前后組織器官的變化情況。因而，近年來，斑馬魚被廣泛應用于藥物的藥理及毒性研究[7，8]。斑馬魚雖然沒有外耳及中耳，但具有典型的內耳結構，其內耳毛細胞及分布在身體側線神經丘上的毛細胞在功能和形態上與哺乳動物內耳毛細胞極為相似[9]。通過特異的免疫熒光染色，能很好的觀察藥物對毛細胞的影響。本實驗將利用斑馬魚來研究氟康唑、聯苯芐唑、制霉菌素的耳毒性，以期建立一種簡便、靈敏、快速、直觀地檢測抗真菌藥物耳毒性的斑馬魚模型和方法。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

斑馬魚胚胎的繁殖以自然成對交配的方式進行。每次交配準備4～5對成年，AB品系斑馬魚，平均每對能產200～300個胚胎。在受精后6小時（即6 hpf）和24 hpf對胚胎進行清理（移除已死亡胚胎），并根據胚胎的發育階段挑選合適的胚胎。在28℃條件下用養魚用水孵育胚胎（養魚用水水質：每1L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導率為480～510 μS/cm；pH 為 6.9～7.2；硬度為 53.7～71.6 mg/L CaCO3）。

1.1.2 實驗用藥，儀器與試劑

氟康唑(批號A536904)、聯苯芐唑（批號150618041）、制霉菌素（批號L1510124）及慶大霉素（阿拉丁，批號39970）用0.1%的二甲基亞砜（DMSO）分別配制成儲備液，-20℃保存儲備液，實驗前根據所需濃度進行稀釋。

熒光立體顯微鏡（Nikon AZ 100,Japan）；解剖顯微鏡(Olympus SZX7,Japan)；6孔板（Nest Biotech）；二甲基亞砜（DMSO，阿拉丁，批號1095515）；DASPEI染料（sigma，批號109k1336）。

1.2 實驗方法

1.2.1 確定三種藥物的最大非致死濃度（MNLC）及10%的致死濃度（LC10）

三種藥物的初始檢測濃度均設計為0.1，1，10，100和500 μg/mL。分別用上述濃度各處理30尾6hpf（受精后6小時）的斑馬魚至5 dpf（受精后5天），每天更換藥水并清除死亡斑馬魚。最后，統計每種藥物不同濃度下6hpf至5 dpf斑馬魚總的死亡數量，使用統計學軟件GraphPad Prism 6.0繪制最佳的濃度效應曲線，經過曲線擬合，分別計算出三種藥物的MNLC和LC10。如果上述初始檢測濃度無法得出MNLC及LC10，則進一步測試藥物濃度低至0.01μg/mL或高至1000 μg/mL。

1.2.2 評價藥物的耳毒性

實驗組：每種藥物選取4個濃度進行檢測（LC10、MNLC、1/3 MNLC 和1/10 MNLC）；陽性對照組（慶大霉素組）：5μg/ml的慶大霉素；陰性對照組：養魚用水；溶劑組：0.1% DMSO[10]。各組均處理30尾6hpf的斑馬魚至5dpf。

（1）分別于3dpf和5dpf在顯微鏡下觀察斑馬魚平衡囊及軀干形態的變化，拍照并保存。

（2）用毛細胞特異性熒光染料DASPEI對5dpf的斑馬魚進行染色。每組隨機選擇10尾斑馬魚，在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚側線神經丘及頭部5個神經丘(O1,O4,MI1,MI2,IO4)毛細胞的分布和排列，用圖像處理軟件進行圖像分析，一方面計算毛細胞熒光強度（S），另一方面數出頭部5個神經丘的毛細胞數量。

1.3 統計學方法

斑馬魚的毛細胞損傷率計算公式如下：

毛細胞損傷率（%）=（S(溶劑組)-S（化合物組））/S（溶劑組）×100%采用單因素方差分析及Dunnett’s T檢驗比較各組間的差異。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MNLC和LC10

三種藥物的初始測試濃度及斑馬魚死亡率見表1，通過表1中的藥物濃度擬合出最佳濃度效應曲線（R2＞0.99），如圖 1，得出藥物的 MNLC 和LC10。氟康唑、聯苯芐唑、制霉菌素的MNLC分別為653.8μg/mL,0.37μg/mL和10.5μg/mL，LC10分別為705.4μg/mL,0.52μg/mL和11.8μg/mL。

表1 藥物濃度及斑馬魚死亡率（n=30）Table 1 The concentration of antifungal drugs and mortality of zebrafish（n=30）

2.2 平衡囊及軀干形態的變化

三種抗真菌藥及慶大霉素組均出現明顯的斑馬魚耳毒性，表現為球囊和橢圓囊大小、形態發生改變，軀干屈曲（見圖2，圖3）。

圖2 斑馬魚平衡囊形態的變化Fig.2 Toxicity of antifungal drugs on statocyst

圖3 斑馬魚軀干形態的變化Fig.3 Toxicity of antifungal drugs on trunk(prone position)

2.3 毛細胞的變化

根據斑馬魚側線神經丘及平衡囊周圍神經丘（O1,O4,MI1,MI2,IO4）的免疫熒光強度，可計算出毛細胞的損傷率，如表2。與陰性對照組比較，慶大霉素組及三種抗真菌藥物組斑馬魚毛細胞的熒光強度均減弱，差異具有統計學意義，P＜0.001。

表2 各組毛細胞的免疫熒光強度及毛細胞損傷率（n=10）Table 2 The hair cells fluorescence intensity and loss rate of zebrafish in different groups（n=10）

為進一步分析抗真菌藥物對毛細胞的影響，數出著色的神經丘O1,O4,MI1,MI2,IO4毛細胞數量，與陰性對照組比較。結果顯示每個神經丘毛細胞數量均減少，差異具有統計學意義，如圖4。

圖4 神經丘O1,O4,MI1,MI2,IO4毛細胞數量的變化Fig.4 The changes in the number of the hair cells treated with antifungal drugs

3 討論

2005年，Ton等提出藥物的斑馬魚耳毒性與對人內耳的毒性存在相關性[11]。利用斑馬魚來研究氨基糖甙類抗生素及抗腫瘤藥物順鉑等耳毒性的實驗證明斑馬魚是良好的篩查藥物耳毒性的模型[12-16]。2008年，Chiu等使用斑馬魚模型篩查了FDA批準使用的1040種藥物，發現21種藥物具有斑馬魚耳毒性，其中2種藥物的毒性作用在進一步的大鼠實驗中得到確認[9]。證明了斑馬魚在篩查藥物耳毒性方面的價值。1957年，學者Schuknechtin首次提出滴耳液可能存在耳毒性[17]。隨后，使用滴耳液導致聽力損失的病例時有報導，相關藥物的耳毒性研究也越來越多[18-20]。

本研究對臨床中常用的三種抗真菌藥物-氟康唑、聯苯芐唑、制霉菌素-進行耳毒性的篩查,發現三種藥物均具有斑馬魚耳毒性，并且存在劑量依賴關系，包括改變球囊、橢圓囊的大小，神經丘毛細胞數量減少，斑馬魚身體側翻。身體的屈曲及側翻可能跟平衡囊毛細胞受到損傷進而影響其功能相關。該模型可快速、靈敏地篩查出抗真菌藥物的耳毒性。本實驗中聯苯芐唑的致死濃度最低，氟康唑的致死濃度最大，說明即使同屬于唑類抗真菌藥，造成斑馬魚毒性作用的藥物濃度也是不一樣的。回顧文獻，尚無利用斑馬魚來研究上述三種抗真菌藥物耳毒性的實驗。少量抗真菌藥物耳毒性的實驗則是使用哺乳動物。Tom LW利用豚鼠對克霉唑、咪康唑、制霉菌素耳毒性的研究示該三種抗真菌藥處理后豚鼠耳蝸毛細胞數量并無減少[21]。Süleyman ?zdemir利用白鼠對奧西康唑耳毒性的研究示奧西康唑處理后白鼠的畸變產物耳聲發射（DPOAE）幅度并無改變[2]。Tom LW的研究使用電鏡直接觀察毛細胞數量的改變，與本研究有相似之處，克霉唑、咪康唑與氟康唑、聯苯芐唑同屬唑類抗真菌藥，但Tom LW等發現豚鼠的毛細胞數量并無減少，而本實驗中氟康唑、聯苯芐唑處理后的斑馬魚毛細胞均有不同程度的減少。可能原因是1.實驗所用藥物濃度不一樣，本研究中選用1/10MNLC,1/3MNLC,MNLC和LC10的藥物濃度，而Tom LW的研究直接選用1%的克霉唑水劑和2%的咪康唑乳膏；2.藥物進入內耳的途徑不一樣，豚鼠屬哺乳動物，有外耳、中耳及內耳，藥物需經過中耳滲透進入內耳，而斑馬魚無中耳結構，藥物直接從表皮滲透進入內耳。奧西康唑也屬于唑類抗真菌藥，Süleyman ?zdemir等的研究證明奧西康唑對白鼠無耳毒性，但所采用的評估方式是對比DPOAE幅度的改變。DPOAE幅度無改變說明藥物對毛細胞整體的功能無影響，而是否造成了毛細胞顯微結構的損傷或壞死未可知。

盡管本實驗結果顯示氟康唑、聯苯芐唑及制霉菌素均具有斑馬魚耳毒性，但并不能直接證明其對人耳具有毒性作用。原因有以下幾方面：1.滴耳液通常用于處于炎癥狀態的皮膚、黏膜，炎癥導致的中耳黏膜水腫、滲出，甚至膿性分泌物均能阻擋藥物進入內耳[22]；2.正常中耳黏膜非常薄，而炎癥狀態的黏膜較厚，降低了黏膜的滲透性，從而減少藥物的滲入[23]；3.斑馬魚無外耳和中耳，缺少中耳黏膜的阻擋。另外，斑馬魚屬于脊椎動物，藥物的代謝過程不同于哺乳動物，并且斑馬魚的毛細胞能在藥物去除后再生，藥物還可通過斑馬魚皮膚、吞咽等吸收進入體內[11]。因此，進一步在哺乳動物體內的研究非常必要。

不足之處：本文側重形態學，沒有電生理學研究資料，稍顯不足；其次，本研究僅初步探索了三種抗真菌藥物的耳毒性現象，而未對其導致毛細胞損害的機制進行深入的研究。在接下去的實驗中，我們將進一步進行機制研究。

4 結論

1.三種抗真菌藥物均具有斑馬魚耳毒性，導致斑馬魚平衡囊軀干形態發生改變，均導致斑馬魚毛細胞數量的減少，并存在劑量依賴關系。2.本實驗通過研究制霉菌素、氟康唑、聯苯芐唑對斑馬魚幼體毛細胞的損傷作用，建立了一種簡便、靈敏、快速、直觀地檢測抗真菌藥物耳毒性的斑馬魚模型和方法。