老年血液循環(huán)因素對(duì)年輕小鼠椎間盤(pán)衰老表型的影響*

雷昌斌 林宏生 唐新文 郭志文 蔡永得 唐 光 王 東 王 炯△

（1 湘南學(xué)院附屬醫(yī)院(臨床學(xué)院)臨床醫(yī)學(xué)研究中心，郴州423000；2 暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，廣州510632 ；3 匹茲堡大學(xué)，弗格森實(shí)驗(yàn)室，Pittsburgh 匹茲堡15261）

隨著人口老齡化進(jìn)程，退變性疾病逐漸成為影響人們健康和生活水平的主要疾病[1]。腰痛也隨之成為第二大常見(jiàn)病及多發(fā)病。據(jù)統(tǒng)計(jì)有超過(guò)80%的人一生中會(huì)出現(xiàn)過(guò)腰痛，是病人手術(shù)的第5 大病因[2]。而椎間盤(pán)退變 (intervertebral disc degeneration, IDD)是引起腰痛的主要病因，造成了重大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)[3]。椎間盤(pán)退變可由衰老、氧化應(yīng)激、炎癥、DNA 損傷、生物力學(xué)改變及全身因素、吸煙、肥胖等引起，其中衰老是引起椎間盤(pán)退變的最重要因素[4,5]。椎間盤(pán)既堅(jiān)韌又富有彈性，具有緩沖脊柱受壓和沖擊的作用。椎間盤(pán)是人體最大的沒(méi)有血液供應(yīng)的器官，內(nèi)部髓核營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物，主要通過(guò)上下終板及纖維環(huán)的外1/3 毛細(xì)血管的滲透作用[4]。衰老的椎間盤(pán)包括脫水、纖維化、裂隙，椎間盤(pán)高度降低等改變，容易造成纖維環(huán)破裂、髓核突出[6]。目前的治療和研究都集中在椎間盤(pán)局部因素使椎間盤(pán)細(xì)胞損傷、細(xì)胞基質(zhì)損失，導(dǎo)致椎間盤(pán)細(xì)胞死亡或衰老[7]。也有少量研究證實(shí)椎間盤(pán)外因素如骨質(zhì)疏松和血管硬化癥[8]、肌營(yíng)養(yǎng)不良[9]等可以加速椎間盤(pán)退變。但是尚無(wú)血液循環(huán)因素對(duì)椎間盤(pán)退變的影響研究。

異時(shí)聯(lián)體共生模型 (heterochronic parabiosis model)通過(guò)將年輕和年老個(gè)體的皮膚及軟組織相連，使個(gè)體間毛細(xì)血管融合達(dá)到血液和代謝產(chǎn)物交換的目的，距今已有150 多年的歷史[10]。聯(lián)體共生模型有在腫瘤、移植、免疫耐受方面的應(yīng)用，但直到20 世紀(jì)中后葉才開(kāi)始在衰老研究中應(yīng)用。Loffredo 等[11]報(bào)道異時(shí)聯(lián)體共生模型通過(guò)血液交換，年輕小鼠血液中生長(zhǎng)分化因子11 (growth differentiation factor 11, GDF11)蛋白可以逆轉(zhuǎn)年老小鼠心肌細(xì)胞衰老肥大。本研究團(tuán)隊(duì)的前期實(shí)驗(yàn)也證實(shí)異時(shí)聯(lián)體共生模型血液循環(huán)因素可以影響脊柱椎旁肌肉組織的衰老退變[12]。椎間盤(pán)是人體最大的缺少血液供應(yīng)器官，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)僅通過(guò)上下椎板及外圍纖維環(huán)滲透吸收。聯(lián)體共生模型能否通過(guò)血液循環(huán)因素影響缺少血液供應(yīng)的椎間盤(pán)組織的衰老退變？因此，我們假設(shè)老年小鼠血液循環(huán)因素可以加速年輕小鼠椎間盤(pán)衰老退變。本研究通過(guò)建立小鼠異時(shí)聯(lián)體共生模型，對(duì)比同時(shí)聯(lián)體(isochronic parabiosis) 共生模型，評(píng)估血液循環(huán)因素對(duì)小鼠脊柱椎間盤(pán)退變的影響，探討其作用機(jī)制，為重新認(rèn)識(shí)椎間盤(pán)衰老的原因并探索新的治療思路提供理論基礎(chǔ)。

方 法

1.試劑與儀器

培養(yǎng)基：90% DMEM/F-12(1X)（Life Technologies 公司，美國(guó)）；10% 胎牛血清 (Fetal Bovine Serum, FBS)（ATLANTA 公司，美國(guó)）。抗體：p16、p21、ADAMTS4、MMP13 (abcam 公司，美國(guó)），LC3（Thermo 公司，美國(guó)）。DAPI：(4', 6-diamidino-2-phenylindole) 即4', 6-二脒基-2-苯基吲哚，規(guī)格：2 ml；型號(hào)：P36935（Invitrogen 公司，美國(guó)）。Quant-iT PicoGreen ds DNA 試 劑 盒（Invitrogen 公司，美國(guó)）；流式細(xì)胞儀：2030 Multilabel Reader VicToR X3（PerkinElmer 公司，美國(guó)）。聚偏二氟乙烯膜（poly vinyli?dene difluoride, PVDF, Bio-Rad公司，美國(guó)），Western Blot 儀器：（Bio-RAD 公司，美國(guó)）。清潔操作臺(tái)、病理切片機(jī)及熒光顯微鏡（Nikon Eclipse Ts100; Nikon 公司，美國(guó)）。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查和審批，并嚴(yán)格遵守國(guó)家衛(wèi)生和醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和管理的相關(guān)指南。選用C57BL/6J 野生型雌性小鼠，其中年輕小鼠選擇3 個(gè)月齡，年老小鼠選18 個(gè)月齡，對(duì)體重?zé)o明顯限制。聯(lián)體手術(shù)后按標(biāo)準(zhǔn)條件下每對(duì)聯(lián)體小鼠單籠飼養(yǎng)，給予充足的食物和水，并注意消毒和使用抗生素預(yù)防聯(lián)體病。

3.動(dòng)物模型的建立和分組

將年輕和年老的小鼠異時(shí)聯(lián)體 (heterochronic parabiosis, Y-O)，年輕和年輕小鼠同時(shí)聯(lián)體 (isochronic parabiosis, Y-Y)，年老的和年老的小鼠同時(shí)聯(lián)體 (isochronic parabiosis, O-O)，分別聯(lián)體融合8周。術(shù)前進(jìn)行1 周的適應(yīng)治療，并注意做好小鼠保溫及清潔消毒，手術(shù)從一側(cè)小鼠上肢肘關(guān)節(jié)沿腹部到下肢膝關(guān)節(jié)處切開(kāi)皮膚，從筋膜層分離皮瓣，為了增大血液交流面積將皮膚及部分腹膜融合，后者注意連續(xù)縫合。麻醉蘇醒后檢測(cè)，可將小鼠放置37℃溫箱有助于小鼠體溫調(diào)節(jié)恢復(fù)。每個(gè)籠子只能飼養(yǎng)一對(duì)共生小鼠，提供充足的水及食物。術(shù)后24 h 從尾部靜脈注射Evan blue 染料檢測(cè)聯(lián)體小鼠是否共享血液循環(huán)。文獻(xiàn)報(bào)道異時(shí)聯(lián)體2 周后，兩個(gè)不同個(gè)體的血液循環(huán)可達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。聯(lián)體8 周后處死小鼠，解剖小鼠脊柱椎間盤(pán)組織檢測(cè)。

4.組織H&E 染色及免疫熒光染色

取各組脊柱腰椎 (L5-6) 功能單位 (functional spine unit, FSU)，F(xiàn)SU 一側(cè)盡量靠近終板避免破壞椎間盤(pán)組織，另一側(cè)保留2 mm 骨組織便于后期包埋操作。將FSU 浸泡在2%多聚甲醛中24 h，用1%PBS 清洗2 遍后加入70%酒精繼續(xù)浸泡24 h，后用石蠟包埋及切片，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)H&E 染色和組織免疫染色(LC3)。

5.組織免疫熒光 (immunofluorescence, IF)

解剖脊柱腰椎 (L1-L4) 椎體功能單位，將FSU 浸泡于2%的多聚甲醛中過(guò)夜，取出后用1%PBS 沖洗3 次，將沖洗后FSU 浸泡在30%的蔗糖溶液中放置4℃房間過(guò)夜。取出FSU 用包埋劑 (optimum cutting temperature, OCT) 包埋（注意將保留骨組織的一端朝上），放置-80℃冰箱1 天后冰凍切片，組織厚度設(shè)定為7 μm，切片需要包括纖維環(huán)組織及內(nèi)部髓核組織。貼片后的載玻片放入1% PBS 液5 min洗3 次，封閉1 h 后加入150 μl 一抗（aggrecan 1:200稀釋） 避光過(guò)夜。第2 天用PBS 液洗5 次，再加入二抗150 μl （抗體按1:500 稀釋），再次用1%PBS液洗5 次后加入DAPI 染色蓋上蓋玻片，注意避光孵育。樣本使用尼康熒光顯微鏡讀片，使用相同的設(shè)置和曝光時(shí)間獲取不同組別的圖像并進(jìn)行等效處理。

6.蛋白印痕檢測(cè) (Western blot analysis)

解剖提取頸椎和胸椎椎間盤(pán)組織，稱重后按1 g:10 ml 加入蛋白裂解液，提取各樣本組織蛋白，平衡蛋白濃度后每孔加入30 μg 蛋白量，使用4%～20%聚丙烯酰胺凝膠跑膠，之后用PVDF 轉(zhuǎn)膜。室溫下在5%的脫脂牛奶封閉1 h。分別加入一抗P16、P21、MMP13、ADAMTS4（1:1000 稀釋）在4℃搖擺平臺(tái)上過(guò)夜。第2天用TBS-T緩沖液清洗3遍PVDF膜，每次10 min，之后在室溫下加入二抗（1:1 0000 稀釋）并避光搖晃1 h。后再用PBS-T 洗滌3 次，使用奧德賽成像儀以化學(xué)顯色蛋白質(zhì)條帶，并且通過(guò)使用儀上的軟件進(jìn)行定量分析。

7. RT-qPCR 檢測(cè)RNA 表達(dá)

解剖提取腰椎L1-L3椎間盤(pán)組織后，用Trizol法提取組織總RNA 并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按照預(yù)先設(shè)定的熱學(xué)過(guò)程： 95℃預(yù)變性 10 min，95℃變性 15 s，58℃退火30 s，62℃延伸1 min，50 個(gè)循環(huán)，保存設(shè)置。用 GAPDH 作為內(nèi)參使基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。每個(gè)樣品做 2 個(gè)復(fù)孔。系統(tǒng)自動(dòng)繪制擴(kuò)增曲線和熔解曲線，并采集CT 值。引物序列(5'-3')：GAPDH 上游引物，GGTTGTCTCCTGCGACTTCA；下游引物，TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC。P16 上游引物，AATCTCCGCGAGGAAAGC；下游引物，GTCTGCAGCGGACTCCAT。P21 上游引物，GGAGACTCTCAGGGTCGAAA；下游引物，GGATTAGGGCTTCCTCTTGG。MMP13 上游引物，TCCCTGCCCCTTCCCTATGGT；下游引物，CTCGGAGCCTGTCAACTGTGGA。ADAMTS4 上游引物，ATGGCTATGGGCACTGTCTC；下游引物，GTGTTTGGTCTGGCACATGG。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用4 組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值，將所有回收的資料統(tǒng)一編號(hào)后，采用Graphpad Prism 7.03 統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述和統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于雙變量非參數(shù)數(shù)據(jù)，采用Mann-Whitney 檢驗(yàn)，用Bonferroni 校正方差分析對(duì)多個(gè)實(shí)驗(yàn)組的數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較。P值取雙側(cè)概率，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述和統(tǒng)計(jì)推斷，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. H&E 染色及免疫組化染色

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從陰性對(duì)照組Y-Y 中可觀察到健康的椎間盤(pán)組織H&E 染色后可見(jiàn)：椎間盤(pán)纖維環(huán)結(jié)構(gòu)完整，纖維環(huán)及髓核組織沒(méi)有裂痕，纖維環(huán)及髓核分界清楚，髓核組織含大量髓核細(xì)胞，基質(zhì)完整；Y-O 組H&E 染色可見(jiàn)：纖維環(huán)基質(zhì)結(jié)構(gòu)破損并出現(xiàn)裂痕，纖維環(huán)及髓核分界不清，髓核細(xì)胞數(shù)相比Y-Y 組明顯減少，O-O 組H&E 染色可見(jiàn)：髓核細(xì)胞大量消失，纖維環(huán)及髓核基質(zhì)出現(xiàn)大量裂痕（見(jiàn)圖1）。

2.組織免疫熒光IF 檢測(cè)aggrecan 表達(dá)

IF 檢測(cè)Y-O 組年輕小鼠aggrecan 含量較Y-Y組年輕小鼠減少了20.1%±3.2%，IF 檢測(cè)O-O 組椎間盤(pán)組織aggrecan 含量較Y-Y 組下降23.9%±3.7%（P＜ 0.05，見(jiàn)圖2）。

3.衰老基因表達(dá)的差異性

本研究檢測(cè)特異性基因P21 及P16 蛋白表達(dá)和RNA 轉(zhuǎn)錄的差異性。Western Blot 檢測(cè)顯示：Y-O組P16 蛋白表達(dá)較Y-Y 組升高77.1±20.5%，O-O 組P16蛋白表達(dá)較Y-Y組升高206.7±53.5% (P＜ 0.05)。Y-O 組P21 蛋白表達(dá)比Y-Y 組有升高趨勢(shì)，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。RT-qPCR 檢測(cè)P16 基因異時(shí)聯(lián)體后有升高的趨勢(shì)但組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。RT-qPCR 檢測(cè)P21 基因三組的表達(dá)分別為Y-Y：1±0、Y-O：1.405±0.067、O-O：1.955±0.242，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜ 0.05，見(jiàn)圖3）。

4.椎間盤(pán)組織金屬蛋白酶表達(dá)差異性

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，MMP13 蛋白表達(dá)及mRNA 基因檢測(cè)均是Y-O 組較Y-Y 組升高，MMP13 蛋白表達(dá)量O-O 組較年輕小鼠Y-Y 組升高，組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜ 0.05)。Western Blot 檢測(cè)椎間盤(pán)基質(zhì)代謝產(chǎn)物ADAMTS4 蛋白表達(dá)分別為Y-Y：1±0、Y-O：1.331±0.085、O-O：2.690±0.324，Y-O 及O-O 組明顯升高，與Y-Y 組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。RT-qPCR 檢 測(cè)ADAMTS4 基 因 表 達(dá)Y-O 組比Y-Y 組升高33.5±22.6%，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，O-O 組與Y-Y 組比較明顯升高，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜ 0.05，見(jiàn)圖4）。

討 論

聯(lián)體共生模型 (parabiosis model) 早在150 年前就已建立，通過(guò)兩個(gè)獨(dú)立的個(gè)體血液融合對(duì)免疫、移植、腫瘤、衰老等進(jìn)行研究[10,13,14]。異時(shí)聯(lián)體共生模型使年輕和年老個(gè)體血液嵌合，從而達(dá)到體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的交換，改變細(xì)胞所處的外環(huán)境[15]。Sinha 等[16]通過(guò)對(duì)小鼠聯(lián)體共生模型研究發(fā)現(xiàn)全身血液環(huán)境中的GDF11 水平的增加可以改善肌肉結(jié)構(gòu)和功能，逆轉(zhuǎn)肌肉衰老。Yamasaki 等[17]使用聯(lián)體共生模型研究外周血細(xì)胞 (peripheral blood cells, PBCs) 對(duì)同樣缺少血液供應(yīng)的關(guān)節(jié)軟骨的影響研究，發(fā)現(xiàn)PBCs 可以修復(fù)早期關(guān)節(jié)軟骨損傷，逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)軟骨退變。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立小鼠同時(shí)和異時(shí)聯(lián)體模型，證實(shí)椎間盤(pán)的衰老不僅受椎間盤(pán)局部因素的影響，血液循環(huán)因素也可以影響椎間盤(pán)組織的衰老退變。

圖1 小鼠腰椎間盤(pán)組織石蠟切片H&E 染色及免疫組化染色小鼠腰椎間盤(pán)組織石蠟切H&E 染色Y-Y 組纖維環(huán)及髓核結(jié)構(gòu)完整，無(wú)裂痕，分界清楚，內(nèi)部髓核基質(zhì)完整，有大量的髓核細(xì)胞；Y-O 組可見(jiàn)纖維環(huán)與髓核交界處分界不清，髓核基質(zhì)部分裂縫（紅色箭頭），內(nèi)部髓核細(xì)胞明顯較Y-Y 組減少；O-O 組可見(jiàn)髓核細(xì)胞減少（紅色三角符號(hào)），基質(zhì)周圍出現(xiàn)裂縫（紅色箭頭） 標(biāo)尺 = 200 μmFig. 1 Impact of circulatory factors from aged mice on gross disc morphology H&E staining of lumbar disc was performed to assess the gross morphological changes with aging. In Y-Y group, the structure of AF and NP was intact, without cracks, and the boundary was clear. There were a lot of NP cells in the inner NP matrix; In the Y-O group, the junction between the AF and NP was not clear, and part of the NP matrix was cracked (red arrow), and the number of NP cells in the Y-O group was significantly less than that in the Y-Y group; In O-O group, the number of NP cells decreased (red triangle symbol), and cracks around the matrix (red arrow). Scale bar = 200 μm

圖 2 血液循環(huán)因素對(duì)年輕小鼠椎間盤(pán)aggrecan 蛋白表達(dá)的影響(n = 4)紅色為aggrecan 染色，藍(lán)色為細(xì)胞核DAPI 染色，可見(jiàn)Y-Y 組紅色aggrecan 明顯較Y-O 及O-O 組多，定量分析顯示各組間有明顯差異，所示數(shù)據(jù)為四組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(±SD)。*P ＜ 0.05Fig. 2 Effects of circulatory factors from aged mice on aggrecan protein expression in intervertebral discs in mouse heterochronic parabionts (n = 4)Red is aggrecan staining, blue is DAPI staining. It can be seen that red aggrecan in Y-Y group is significantly more than that in Y-O and O-O groups. Quantitative analysis shows that there are significant differences among the groups. Data shown are ±SD of 4 independent experiments, *P ＜ 0.05.

圖3 血液循環(huán)因素對(duì)小鼠異時(shí)聯(lián)體椎間盤(pán)衰老基因蛋白和基因表達(dá)的影響 (n = 4)(A) Western Blot 檢測(cè)結(jié)果顯示Y-O 及O-O 組衰老基因P16 表達(dá)量較Y-Y 組升高；(B) P16 蛋白表達(dá)量Western Blot 定量分析結(jié)果；(C) P16 基因RT-qPCR 定量檢測(cè)結(jié)果；(D) Western Blot 檢測(cè)結(jié)果顯示O-O 組衰老基因P21 表達(dá)量較Y-Y 組明顯升高；(E) P21 蛋白表達(dá)量Western Blot 定量分析結(jié)果，Y-O 組較Y-Y 組升高不明顯；(F) P21基因RT-qPCR 定量檢測(cè)結(jié)果，Y-O 及O-O 組表達(dá)量較Y-Y 組明顯升高。*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，*** P ＜0.001Fig. 3 Effects of circulatory factors from aged mice on expression of cellular senescence markers in IVDs in mouse heterochronic parabiotants (n = 4)(A) The expression of P16 was detected by Western blot; (B) P16 in Y-O and O-O groups was higher than that in Y-Y group; (C)P16 gene was detected by RT-qPCR; (D) The expression of P21 was detected by Western blot; (E) Western blot analysis showed that the expression of P21 protein in Y-O group was not signifciantly higher than that in Y-Y group; (F) The expression of P21 gene in Y-O and O-O groups was signifciantly higher than that in Y-Y group. *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001.

1.老年血液循環(huán)因素對(duì)椎間盤(pán)組織形態(tài)的影響

本研究中通過(guò)異時(shí)聯(lián)體，椎間盤(pán)組織石蠟切片H&E 染色見(jiàn)，通過(guò)老年小鼠血液環(huán)境的影響年輕小鼠椎間盤(pán)組織中央的髓核細(xì)胞明顯減少，并且纖維環(huán)組織出現(xiàn)裂痕，纖維環(huán)及髓核交界處分界不清楚。Isaac 等[9]對(duì)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥 (duchenne muscular dystrophy, DMD) 模型研究中發(fā)現(xiàn)，肌肉組織的退化可以加速脊柱椎間盤(pán)組織的退變。這些都證明椎間盤(pán)外的因素可以影響椎間盤(pán)組織和細(xì)胞的衰老退變。Smith 等[18]報(bào)道衰老的系統(tǒng)環(huán)境中免疫相關(guān)分子和細(xì)胞變化可以負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞的形成和分化。

圖 4 血液循環(huán)對(duì)小鼠異時(shí)聯(lián)體椎間盤(pán)分解代謝蛋白和基因表達(dá)的影響(n = 4)(A) Western Blot 檢測(cè)各組MMP13 蛋白印痕結(jié)果；(B) MMP13 蛋白表達(dá)量Western Blot 定量分析結(jié)果；(C)MMP13 基因RT-qPCR 定量檢測(cè)結(jié)果；(D) Western Blot 檢測(cè)各組ADAMTS4 蛋白印痕結(jié)果；(E) ADAMTS4 蛋白表達(dá)量Western Blot 定量分析結(jié)果；(F) ADAMTS4 基因RT-qPCR 定量檢測(cè)結(jié)果。*P ＜ 0.05Fig. 4 Effects of circulatory factors from aged mice on catabolic gene expression in intervertebral discs obtained from mouse heterochronic parabionts (n = 4)(A) MMP13 protein was detected by Western blot; (B) The expression of MMP13 protein was analyzed by Western blot;(C) MMP13 gene was detected by RT-qPCR; (D) ADAMTS4 protein was detected by Western blot; (E) The expression of ADAMTS4 protein was analyzed by Western blot; (F) ADAMTS4 gene was detected by RT-qPCR. *P ＜ 0.05.

2.老年血液循環(huán)因素對(duì)椎間盤(pán)細(xì)胞衰老基因表達(dá)的影響

文獻(xiàn)報(bào)道，椎間盤(pán)衰老細(xì)胞 (senescent cells,SnCs) 可以引起細(xì)胞DNA 損傷、炎癥反應(yīng)、造成細(xì)胞基質(zhì)分解代謝和合成代謝失平衡等加速細(xì)胞衰老退變[19]。其中P53-P21-Rb 和P16-Rb 信號(hào)通路被激活，是調(diào)控細(xì)胞衰老的重要通路[20]。衰老細(xì)胞內(nèi)P53-P21-Rb 和P16-Rb 信號(hào)通路被激活，導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)制停止在G1 期和抑制CDK4、CDK6 導(dǎo)致Rb 和Hb 的低磷酸化狀態(tài)引起細(xì)胞衰老。Liu 等[21]Western Blot 檢測(cè)小鼠異時(shí)聯(lián)體共生年輕與年老小鼠聯(lián)體后腎臟組織中P16 蛋白表達(dá)量比年輕與年輕小鼠同時(shí)聯(lián)體時(shí)升高。本研究RT-qPCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)老年小鼠椎間盤(pán)組織mRNA 中衰老基因P16 及P21 基因的表達(dá)較年輕小鼠明顯升高。異時(shí)聯(lián)體共生組 (Y-O)椎間盤(pán)組織P16、P21 的蛋白表達(dá)明顯較同時(shí)聯(lián)體共生組 (Y-Y) 升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。因此，異時(shí)聯(lián)體共生，老年小鼠血液環(huán)境可以加速衰老基因的表達(dá)。

3.老年血液循環(huán)因素對(duì)椎間盤(pán)組織基質(zhì)代謝的影響

椎間盤(pán) (intervertebral disc, IVD) 主要由上下椎板、外圍纖維環(huán)及內(nèi)部髓核組成，其主要成分為糖胺聚糖 (glycosaminoglycans, GAG)、I 和II 型膠原蛋白 (collagen) 及聚蛋白多糖 (proteoglycan) 為基礎(chǔ)組成[22]。聚糖蛋白聚糖 (aggrecan)是椎間盤(pán)組織基質(zhì)的重要成分，隨著椎間盤(pán)衰老會(huì)出現(xiàn)纖維化、蛋白水解及水分含量下降導(dǎo)致aggrecan 含量減少[23]。本研究IF 檢測(cè)異時(shí)聯(lián)體后Y-O 組椎間盤(pán)中aggrecan 含量較Y-Y 組減少，導(dǎo)致椎間盤(pán)基質(zhì)含水量減少、彈性下降，加速細(xì)胞凋亡。金屬蛋白酶與腫瘤細(xì)胞遷移、細(xì)胞外基質(zhì)降解和細(xì)胞凋亡相關(guān)，椎間盤(pán)組織衰老與金屬蛋白酶MMP13、ADAMTS4表達(dá)呈正相關(guān)。與此同時(shí)金屬蛋白酶MMP13 及ADAMTS4 可以加快細(xì)胞外基質(zhì)降解，ADAMTS4可以酶切aggrecan 多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，降解蛋白多糖核心結(jié)構(gòu)[24]。異時(shí)聯(lián)體共生老年血液循環(huán)因素可以使年輕小鼠椎間盤(pán)MMP13、ADAMTS4蛋白表達(dá)升高，促進(jìn)年輕小鼠椎間盤(pán)組織老化，但其具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，異時(shí)聯(lián)體共生模型通過(guò)血液循環(huán)因素，可以影響小鼠脊柱椎間盤(pán)組織的衰老退變，老年小鼠血液循環(huán)因素可以加速年輕小鼠椎間盤(pán)組織衰老。全身血液環(huán)境通過(guò)椎間盤(pán)組織營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收與交換，調(diào)控椎間盤(pán)外周基質(zhì)的分解與合成代謝的平衡、促進(jìn)自噬、氧自由基清除及干細(xì)胞修復(fù)等方面影響脊柱椎間盤(pán)組織的衰老進(jìn)程。因此，在治療椎間盤(pán)退變的同時(shí)不僅需要考慮椎間盤(pán)局部因素，也需要考慮全身血液循環(huán)因素對(duì)椎間盤(pán)組織的影響。另外，需要進(jìn)一步研究血液循環(huán)因素影響脊柱椎間盤(pán)衰老的作用機(jī)制及具體通路的分子調(diào)控關(guān)系。