遠志提取物對抑郁大鼠腸道菌群的作用研究

陳啟軍，于 嵐，趙文文，許榮蓉，陳筱清，吳 霞，巴寅穎

遠志提取物對抑郁大鼠腸道菌群的作用研究

陳啟軍，于 嵐，趙文文，許榮蓉，陳筱清，吳 霞*，巴寅穎*

首都醫科大學中醫藥學院，中醫絡病研究北京市重點實驗室，北京 100069

探討遠志提取物對抑郁大鼠腸道菌群的影響及其可能的作用機制。采用孤養結合慢性不可預知性溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）方法建立抑郁大鼠模型，SD大鼠隨機分為對照組、空白給藥組、模型組、氟西?。? mg/kg）組和遠志提取物高、中、低劑量（1.5、1.0、0.5 g/kg）組。觀察各組大鼠行為學并檢測海馬組織單胺類神經遞質及其代謝物水平；采用ELISA法檢測大鼠血清中促腎上腺皮質激素釋放因子（corticotropin-releasing factor，CRF）、促腎上腺皮質激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）、皮質酮（corticosterone，CORT）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）水平；采用透射電鏡（TEM）觀察大鼠十二指腸和結腸上皮的超微結構變化；采用16S rRNA測序檢測大鼠糞便腸道菌群的結構變化。與模型組比較，遠志提取物可明顯改善大鼠的抑郁樣行為（＜0.05、0.01、0.001），顯著升高海馬組織中去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、二羥基苯乙酸（dihydroxyphenyl acetic acid，DOPAC）和5-羥吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA）水平（＜0.05、0.01、0.001），顯著降低血清中CRF、ACTH、CORT、IL-6和LPS水平（＜0.01、0.001），減輕其下丘腦-垂體-腎上腺皮質（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸的功能亢進狀態；同時遠志提取物對大鼠腸道內的菌群失調具有調節作用。遠志提取物可以通過改善腸道菌群結構、恢復腸屏障功能、降低腸源性內毒素釋放、減輕機體炎癥水平，從而發揮抗抑郁作用。

遠志提取物；抑郁癥；慢性不可預知性溫和應激；腸道菌群；16S rRNA

抑郁癥是常見的情感障礙性精神疾病，其臨床表現為情緒低落、食欲不振、思維遲鈍、言語興趣減退、失眠等，患者嚴重時常有自殺傾向[1]。據世界衛生組織最新統計顯示，預測到2030年，抑郁癥將成為全球疾病負擔的主要原因[2]。抑郁癥發病機制復雜，通常認為其與腦內5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）等神經遞質減少以及下丘腦-垂體-腎上腺皮質（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸功能亢進和免疫炎癥系統異常等因素有關[3]。研究表明，抑郁癥患者與健康人群的腸道菌群結構存在差異，抑郁癥患者腸道內擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）相對豐度明顯升高，厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度顯著降低[4]。研究發現，通過調節腸道菌群能夠改善抑郁癥患者或抑郁模型動物的抑郁癥狀。腸道菌群的改變可通過HPA軸、免疫炎癥反應、神經遞質信號傳導影響中樞神經系統，進而參與抑郁癥的發生發展[4]。抑郁癥患者常伴有腸屏障功能障礙、壓力應激和HPA軸功能亢進，腸黏膜的通透性增加[5]。腸屏障受損不僅會破壞腸道菌群平衡，腸道菌群的失衡及腸黏膜通透性增加也會導致腸道內毒素增加并大量進入到血及組織中，進而促進細胞因子、炎性介質釋放，進一步加重腸道屏障損傷，同時啟動系統性炎癥反應，而炎癥反應導致的神經功能的改變在抑郁癥發病過程中起到重要作用[6]。

遠志為遠志科植物遠志Willd.或卵葉遠志L.的干燥根，具有安神益智、交通心腎的功效，臨床上常用于治療失眠、多夢、心悸、神志恍惚等癥狀[7]?，F代藥理學研究表明，遠志能夠通過影響單胺類神經遞質功能、拮抗HPA軸功能亢進、上調腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase B，TrkB）表達等，從而發揮抗抑郁作用[8]。遠志皂苷和遠志寡糖酯類為遠志提取物中的抗抑郁活性成分，但這2類成分吸收差、生物利用度低[9-12]，提示其可能通過調節腸道微生態發揮抗抑郁作用。本研究采用孤養結合慢性不可預知溫和刺激（chronic unpredicted mild stress，CUMS）建立抑郁大鼠模型，評價遠志提取物對抑郁大鼠行為學指標、海馬組織神經遞質水平、HPA軸功能、腸屏障功能及腸道菌群結構的影響，探討腸道菌群在遠志治療抑郁癥中的作用，并以京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數據庫為基礎進行菌群功能預測分析，尋找顯著改變的代謝途徑，分析遠志抗抑郁作用的可能通路，為進一步闡明其作用機制提供理論依據。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD雄性大鼠56只，6周齡，體質量220～250 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SYXK（京）2010-0020。動物于溫度（24±1）℃、相對濕度（60±5）%、自然晝夜節律光照環境，適應性飼養1周。動物實驗經首都醫科大學實驗動物倫理委員會批準（批準號AEEI-2015-054）。

1.2 藥材

遠志飲片（批號18070101，產地為山西）購自北京人衛中藥飲片廠，由首都醫科大學中醫藥學院羅容副教授鑒定為遠志科植物遠志Willd.的干燥根。

1.3 藥品與試劑

3,6′-二芥子?；崽牵ㄙ|量分數≥98%，批號PRF8041747）、細葉遠志苷A（質量分數≥98%，批號PRF9011241）、遠志皂苷B（質量分數≥98%，批號PRF8112741）購自成都普瑞法科技開發有限公司；鹽酸氟西汀膠囊（批號J2017002，20 mg/粒）購自禮來蘇州制藥有限公司；大鼠促腎上腺皮質激素釋放因子（corticotropin-releasing factor，CRF）ELISA試劑盒（批號BG20190713RAC）、促腎上腺皮質激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）ELISA試劑盒（批號BG20190713RAC）、皮質酮（corticosterone，CORT）ELISA試劑盒（批號BG20190713RAC）、大鼠脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）ELISA試劑盒（批號BG200831RAC）購自上海藍基生物科技有限公司；大鼠白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號R200827-003a）購自欣博盛生物科技有限公司；糞便DNA提取試劑盒（批號51504）購自德國QIAGEN公司；5-HT（批號H9523）、NE（批號A7257）、多巴胺（dopamine，DA，批號H8502）購自美國Sigma-Aldrich公司；5-羥吲哚乙酸（5-hydroxy- indoleacetic acid，5-HIAA，批號H8876）、高香草酸（high vanillic acid，HVA，批號H1252）和二羥基苯乙酸（dihydroxyphenyl acetic acid，DOPAC，批號850217）對照品購自美國Sigma-Aldrich公司，質量分數≥98%。

1.4 儀器

HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；旋轉蒸發儀（日本EYELA公司）；低溫冷凍離心機（美國Sigma公司）；DYY-7C電泳儀（北京六一儀器廠）；NanoDrop 1000紫外分光光度計、U3000超高液相色譜儀（美國Thermo公司）；GelDocXR凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；ELX800酶標儀（美國Bio Tek公司）；曠場實驗系統（上海欣軟信息科技有限公司）；Waters 2965高效液相色譜系統（美國Waters公司）；HT7700透射電子顯微鏡（TEM，日本日立公司）。

2 方法

2.1 混合對照品的制備

分別取3,6′-二芥子酰基蔗糖、細葉遠志苷A、遠志皂苷B對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成質量濃度為0.332、0.410、0.406 mg/mL的3,6′-二芥子?；崽?、細葉遠志苷A、遠志皂苷B儲備液。精密量取以上對照品儲備液，配制成3,6′-二芥子?；崽?、細葉遠志苷A、遠志皂苷B質量濃度分別為0.111、0.068、0.203 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2 遠志提取物的制備

稱取遠志飲片1.2 kg，加入8倍量60%乙醇回流提取1.5 h，共提取3次，合并提取液，濾過，回收乙醇得到遠志提取物528 g，出膏率為44%。采用超高效液相色譜法（ultra-performance liquid chromatography，UPLC）對遠志提取物中3,6′-二芥子酰基蔗糖、細葉遠志苷A和遠志皂苷B的含量進行測定。色譜柱為Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～3 min，15%～20% A；3～8 min，20%～27% A；8～12 min，27%～36% A；12～30 min，36% A；體積流量為0.4 mL/min；柱溫為40 ℃；檢測波長為330 nm。

2.3 CUMS模型建立、分組與給藥

SD大鼠隨機分為對照組、空白給藥組、模型組、鹽酸氟西?。? mg/kg）組和遠志提取物高、中、低劑量（1.5、1.0、0.5 g/kg，分別相當于臨床1.5倍劑量、臨床等效劑量、臨床0.5倍劑量），每組8只。除對照組和空白給藥組，其余各組采用孤養結合CUMS方法建立抑郁大鼠模型[13]。應激方式包括禁水24 h、禁食24 h、潮濕墊料24 h、4 ℃冰水游泳5 min、夾尾1 min、束縛2 h、頻閃24 h、噪音24 h、光照24 h，每天隨機安排1～2種刺激，持續8周。遠志提取物以蒸餾水配制成質量濃度為132、88、44 mg/mL的溶液，分別用作遠志提取物高、中、低劑量組。造模同時，各給藥組大鼠ig相應藥物（5 mL/kg），空白給藥組大鼠ig等體積高劑量遠志提取物，對照組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續8周，每2周記錄大鼠體質量。

2.4 遠志提取物對抑郁大鼠行為學的影響

參照文獻方法[14]，第8周測定大鼠的糖水偏好率、曠場行為（總移動距離、中央區逗留時間和直立次數）和強迫游泳不動時間。

2.5 遠志提取物對抑郁大鼠血清中CORT、CRF、ACTH、IL-6和LPS水平的影響

行為學測試結束后，大鼠ip戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，靜置1～2 h，4 ℃、3000 r/min離心15 min，收集血清，于?80 ℃保存。按照ELISA試劑盒說明書檢測大鼠血清中CRF、ACTH、CORT、IL-6和LPS水平。

2.6 遠志提取物對抑郁大鼠海馬組織中單胺類神經遞質及其代謝物水平的影響

行為學測試結束后，大鼠斷頭取海馬組織，稱定質量，加入120 μL冰冷樣品預處理A液（0.4 mol/L高氯酸），冰浴中快速勻漿，靜置30 min，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，吸取上清液90 μL，加入45 μL樣品預處理B液（20 mmol/L檸檬酸鉀、0.3 mol/L磷酸氫二鉀、2 mmol/L EDTA·2Na），渦旋混勻，冰浴靜置30 min，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，吸取上清液，經0.22 μm濾膜濾過。根據文獻方法[15]，使用Waters 2965高效液相色譜系統檢測海馬組織中DA、5-HT、NE、DOPAC、5-HIAA、HVA水平。色譜柱為Waters symmetry shield RP 18（150 mm×3.9 mm，5 μm）；流動相為緩沖鹽溶液（50 mmol/L單水檸檬酸、70 mmol/L無水乙酸鈉、10 mmol/L EDTA·2Na、180 mmol/L辛烷磺酸鈉）-甲醇（92∶8）；體積流量為0.8 mL/min；檢測電壓為0.6 V；柱溫為30 ℃；進樣量為40 μL。

2.7 遠志提取物對抑郁大鼠十二指腸和結腸上皮超微結構的影響

取大鼠十二指腸和結腸上皮組織，于2.5%戊二醛緩沖液中固定2 h，用0.1 mol/L PB緩沖液洗滌15 min，洗滌3次；于1%鋨酸中固定1 h，乙醇梯度脫水、環氧樹脂包埋后切片（厚50～70 nm）。于TEM下觀察十二指腸和結腸上皮的超微結構變化。

2.8 腸道菌群16S rRNA基因測序分析

行為學測試結束后，收集大鼠新鮮糞便，于?80 ℃保存。采用糞便DNA提取試劑盒提取糞便樣品總DNA，NanoDrop1000測定DNA質量濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質量。采用引物338F和806R通過PCR擴增樣品的V3～V4區域，進行純化與定量后，構建測序文庫。使用QIIME軟件，對有效序列按97%序列相似度進行歸并和可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）劃分，以每個OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列。將OTU的代表序列與Greengenes數據庫（Release 13.8）中的模板序列進行比對，得到所有OTU在微生物門、綱、目、科、屬、種分類水平下的菌群數信息。通過分類學組成分析、α多樣性分析、β多樣性分析和KEGG代謝途徑預測分析等方法對糞便腸道菌群進行分析。

2.9 統計學分析

3 結果

3.1 遠志提取物中3,6′-二芥子?；崽恰⒓毴~遠志苷A和遠志皂苷B的含量

經方法學考察，遠志提取物中3,6′-二芥子?；崽?、細葉遠志苷A和遠志皂苷B分別在0.008 3～0.332 0、0.010 2～0.410 0、0.010 1～0.406 0 mg/mL呈現良好的線性關系；3種成分的平均加樣回收率分別為101.22%、100.46%、99.70%，RSD分別為1.67%、2.81%、2.93%；精密度RSD分別為0.90%、1.27%、1.06%；重復性RSD分別為2.57%、2.66%、2.34%；24 h穩定性RSD分別為1.56%、1.92%、2.03%。UPLC色譜圖見圖1，運用該方法測得遠志提取物中3,6′-二芥子?；崽恰⒓毴~遠志苷A和遠志皂苷B的質量分數分別為9.77、3.89、15.94 mg/g。

1-3,6′-二芥子?；崽?2-細葉遠志苷A 3-遠志皂苷B

3.2 遠志提取物對抑郁大鼠體質量的影響

如圖2所示，與對照組比較，自第21天開始模型組大鼠體質量顯著降低（＜0.001）；與模型組比較，自第35天開始氟西汀組大鼠體質量明顯增加（＜0.05、0.001），遠志提取物各劑量組大鼠體質量呈升高趨勢。

3.3 遠志提取物對抑郁大鼠抑郁樣行為的影響

糖水偏好實驗、曠場實驗和強迫游泳實驗分別反映了大鼠的快感缺失程度、新環境探究欲望和行為絕望程度。如圖2所示，與對照組比較，模型組大鼠糖水偏好率、曠場實驗運動總距離和直立次數顯著降低（＜0.001），強迫游泳不動時間顯著升高（＜0.001），曠場中央區活動時間呈降低趨勢；與模型組比較，遠志提取物各劑量組大鼠糖水偏好率、曠場實驗運動總距離和直立次數均顯著升高（＜0.01、0.001），強迫游泳不動時間顯著降低（＜0.001）；遠志提取物高劑量組大鼠曠場中央區活動時間顯著增加（＜0.05）。

3.4 遠志提取物對抑郁大鼠海馬中單胺類神經遞質及其代謝物水平的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組大鼠海馬NE、5-HT、DA、DOPAC、5-HIAA水平明顯降低（＜0.05、0.01、0.001）；與模型組比較，遠志提取物各劑量組大鼠海馬NE和5-HT水平明顯升高（＜0.01、0.001），遠志提取物中劑量組大鼠海馬DOPAC和5-HIAA水平顯著升高（＜0.05、0.01），遠志提取物低劑量組大鼠海馬5-HIAA水平顯著升高（＜0.05）。

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

表1 遠志提取物對抑郁大鼠海馬中單胺類神經遞質及其代謝物水平的影響()

與對照組比較：#＜0.05##＜0.01###＜0.001；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001

##< 0.05##< 0.01###< 0.001control group;*< 0.05**< 0.01***< 0.001model group

3.5 遠志提取物對抑郁大鼠HPA軸的影響

如圖3所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中CORT、ACTH和CRF水平均顯著升高（＜0.001），表明HPA軸功能呈亢進狀態；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中CORT、ACTH和CRF水平均顯著降低（＜0.01、0.001），表明HPA軸功能亢進狀態得到改善。

3.6 遠志提取物對抑郁大鼠血清中IL-6和LPS水平的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中IL-6和LPS水平顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，遠志提取物高、中劑量組大鼠血清中IL-6和LPS水平顯著降低（＜0.01、0.001），遠志提取物低劑量組大鼠血清中IL-6水平顯著降低（＜0.001）。

3.7 遠志提取物對抑郁大鼠十二指腸和結腸上皮超微結構的影響

如圖5所示，對照組大鼠十二指腸和結腸上皮的絨毛豐富有序、結構完整，細胞間緊密連接正常；模型組大鼠十二指腸和結腸上皮黏膜嚴重受損，絨毛稀疏、萎縮甚至脫落，細胞間緊密連接的間隙增大，杯狀細胞明顯增多且呈空泡狀，排列紊亂、形態異常，杯狀細胞的黏蛋白顆粒分泌增多，顆粒缺乏包膜，主要為急性炎癥表現；遠志提取物高劑量組大鼠腸黏膜損傷得到改善，十二指腸和結腸上皮的絨毛致密，排列整齊、結構完整，緊密連接恢復正常，杯狀細胞較模型組減少，腸黏膜通透性降低。

圖3 遠志提取物對抑郁大鼠血清中CORT、ACTH和CRF水平的影響()

圖4 遠志提取物對抑郁大鼠血清中IL-6和LPS水平的影響()

圖5 遠志提取物對抑郁大鼠十二指腸(A) 和結腸上皮(B) 超微結構的影響

3.8 大鼠腸道菌群16S rRNA基因測序分析

3.8.1 遠志提取物對抑郁大鼠腸道菌群多樣性的影響 如圖6所示，與對照組比較，空白給藥組大鼠的腸道菌群在屬水平的Shannon指數無明顯差異，模型組大鼠腸道菌群在屬水平的Shannon指數顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，氟西汀組和遠志提取物高劑量組大鼠腸道菌群在屬水平的Shannon指數顯著降低（＜0.001），表明遠志提取物能夠降低抑郁大鼠腸道菌群豐富度和多樣性。β多樣性分析通常從計算樣本之間的距離矩陣開始，以確定樣本之間微生物組成結構的差異。主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA）結果顯示，模型組大鼠的腸道菌群結構與對照組明顯分離，遠志提取物組大鼠菌群結構偏離模型組，向對照組靠近，氟西汀組大鼠腸道菌群與對照組存在明顯差異，空白給藥組大鼠腸道菌群與對照組無明顯差異。

3.8.2 遠志提取物對抑郁大鼠腸道菌群生物分類組成的影響 如圖7-A所示，在門水平上，各組大鼠糞便中厚壁菌門和擬桿菌門是最豐富的菌群。如圖7-B所示，與對照組比較，模型組大鼠腸道內厚壁菌門和放線菌門相對豐度明顯降低（＜0.05、0.01），擬桿菌門和變形桿菌門相對豐度顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，遠志提取物高劑量組腸道內厚壁菌門和放線菌門相對豐度明顯升高（＜0.05、0.001），擬桿菌門和變形桿菌門相對豐度顯著降低（＜0.001）。

圖6 遠志提取物對抑郁大鼠腸道菌群Shannon指數和PCoA的影響(n = 6)

圖7 遠志提取物對抑郁大鼠腸道菌群在門水平上的物種相對豐度(A) 和顯著變化菌群相對豐度(B) 的影響(n = 6)

如圖8所示，在科水平上，模型組大鼠的腸道菌群結構與對照組明顯不同，遠志提取物高劑量組大鼠的腸道菌群與對照組聚為一類，表明遠志提取物高劑量組與對照組的腸道菌群結構相似性較高。與對照組比較，模型組大鼠腸道內瘤胃菌科（Ruminococcaceae）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）相對豐度明顯降低（＜0.05、0.001），S24-7科（Muribaculaceae）和乳桿菌科（Lactobacillaceae）相對豐度顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，遠志提取物高劑量組大鼠腸道內瘤胃菌科和毛螺菌科相對豐度明顯升高（＜0.05、0.01），S24-7科和乳桿菌科相對豐度顯著降低（＜0.05）。

如圖9所示，在屬水平上，模型組大鼠腸道菌群結構與對照組明顯不同，遠志提取物高劑量組與對照組大鼠腸道菌群聚為一類，相似性較高。與對照組比較，模型組大鼠腸道內乳桿菌屬Lachnospiraceae_NK4A136_group、Ruminococcaceae_UCG_005_group和羅氏菌屬相對豐度明顯降低（＜0.05、0.001），擬桿菌屬顫桿菌屬和腸單胞球菌屬相對豐度顯著升高（＜0.001），Ruminococcaceae_UCG_014相對豐度呈降低趨勢；與模型組比較，遠志提取物高劑量組大鼠腸道內Ruminococcaceae_UCG_014、Lachnospiraceae_ NK4A136_group和_ group相對豐度明顯升高（＜0.01、0.001），擬桿菌屬、顫桿菌屬和腸單胞球菌屬相對豐度顯著降低（＜0.001）。

3.8.3 標志菌群分析 采用線性判別分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）在不同組間定位具有統計學意義的標志菌群（＜0.01、lg(LefSe評分)＞4.0）。如圖10所示，LefSe分析發現了21個已鑒定的標志菌群，其中Ruminococcaceae_UCG_014是模型組的標志菌群，Lachnospiraceae_NK4A136_group是遠志提取物高劑量組的標志菌群。

圖8 遠志提取物對抑郁大鼠腸道菌群在科水平上的熱圖分析(A) 和顯著變化菌群相對豐度(B) 的影響(n = 6)

圖9 遠志提取物對抑郁大鼠腸道菌群在屬水平上的熱圖分析(A) 和顯著變化菌群相對豐度(B) 的影響(n = 6)

3.8.4 腸道菌群KEGG分析 如圖11所示，與模型組比較，遠志提取物高劑量組大鼠腸道菌群的脂質代謝、脂肪酸代謝和糖代謝途徑存在明顯差異（＜0.05）。

圖10 標志菌群LefSe分析

圖11 腸道菌群KEGG分析

4 討論

抑郁癥是常見的、反復發作的精神心理障礙性疾病，其發病機制尚未完全明確。應激因素在抑郁癥的發病過程中起著關鍵作用，長期壓力應激是形成抑郁的主要因素。本研究采用孤養結合CUMS方法建立抑郁大鼠模型，大鼠隨機給予多變性和不可預測性應激因子刺激，與人類抑郁癥的致病過程存在相似性。本研究結果顯示，模型組大鼠體質量降低，表現出快感缺失、絕望行為增加、自主活動性降低以及對新環境的探索欲望降低的抑郁樣行為，海馬組織中DA、5-HT、NE、DOPAC、5-HIAA水平明顯降低，神經遞質功能減退，并出現了HPA軸功能亢進；遠志提取物能夠改善抑郁大鼠的抑郁樣行為，增強大鼠海馬組織中單胺類神經遞質水平，并下調HPA軸CORT、ACTH和CRF水平，具有良好的抗抑郁作用。此外，本研究發現遠志提取物具有調節腸道菌群的作用。在腸道菌群結構分析中，α多樣性主要用來反映菌群物種豐富度和均勻度。抑郁癥患者及抑郁模型動物腸道菌群的豐富度和多樣性增加[16]。PCoA用可視化方法直接觀察了不同組別間菌群的差異，本研究結果顯示，模型組大鼠腸道菌群結構發生顯著改變，遠志提取物使大鼠腸道菌群結構更接近對照組，與文獻報道相符。

研究表明，抑郁癥患者或抑郁模型動物腸道菌群的物種組成發生顯著變化；在門水平上，抑郁模型動物腸道內擬桿菌門和變形桿菌門相對豐度增加，厚壁菌門和放線菌門相對豐度降低，放線菌門可能是氯胺酮抗抑郁的標志菌群[17-18]。本研究結果顯示，遠志提取物能夠顯著降低抑郁大鼠腸道內擬桿菌門和變形桿菌門相對豐度，顯著升高厚壁菌門和放線菌門相對豐度，表明遠志提取物可以調節抑郁大鼠的腸道菌群組成并改善腸道菌群結構。

屬水平的菌群物種組成分析結果顯示，抑郁模型大鼠腸道內乳桿菌屬Ruminococcaceae_UCG_ 014、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Ruminococcaceae_UCG_005_group和羅氏菌屬相對豐度降低，上述菌屬均與維護腸屏障功能有關。其中羅氏菌屬、Ruminococcaceae_UCG_014和Lachnospiraceae_ NK4A136_group能夠產生短鏈脂肪酸[19-20]，短鏈脂肪酸是腸道菌群及其宿主腸上皮細胞的重要能量來源，能夠維持腸道酸堿平衡、修復腸黏膜損傷、緩解腸道炎癥反應、調節宿主腸道免疫并抑制有害病原菌生長[21]。羅氏菌屬和Lachnospiraceae_ NK4A136_group是產生丁酸鹽的主要菌屬[22-23]，富含這2個菌屬的小鼠腸上皮氧化和炎癥損傷會減少[24]。Lachnospiraceae_NK4A136_group與維護腸屏障完整性的因素呈正相關，與結腸中的促炎因子（LPS、IL-6）呈負相關[25]；_group相對豐度越低，腸道屏障越容易被破壞[26]。本研究發現，模型組大鼠腸道內上述腸屏障保護功能菌相對豐度減少，腸屏蔽功能受損，腸黏膜炎癥反應加重；遠志提取物能夠升高抑郁大鼠腸道內上述菌群相對豐度，恢復腸屏障功能。此外，本研究發現模型組大鼠腸道內擬桿菌屬和顫桿菌屬相對豐度顯著增加。嚴重抑郁癥和躁郁癥患者腸道內顫桿菌屬相對豐度增加[27]。擬桿菌屬是一種革蘭陰性菌，能夠釋放LPS，LPS在腸屏障功能受損后更易被吸收入血，進而誘導外周和中樞促炎癥細胞因子釋放[28]；促炎癥因子在抑郁癥的發病機制中起到重要的作用，抑郁癥患者體內的促炎癥因子水平高于健康人群[29]。本研究結果顯示，與對照組比較，抑郁模型大鼠血清中LPS和促炎因子IL-6水平顯著升高；遠志提取物組大鼠腸道內擬桿菌屬和顫桿菌屬相對豐度降低，血清中LPS、IL-6水平顯著降低，提示遠志提取物的抗抑郁作用可能與增加腸屏障保護功能菌、改善腸屏障功能，進而降低腸源性內毒素釋放、減輕機體炎癥水平有關。

研究表明，腸道菌群與HPA軸的功能和神經遞質系統關系密切。HPA軸亢進會引起皮質醇分泌增多，進而增加腸黏膜通透性并使腸道菌群組成發生變化，升高血清中LPS水平；將正常動物的糞菌移植到抑郁模型動物中，能夠改善抑郁模型動物的HPA軸功能[30]。腸道菌群不僅能夠直接合成或分泌5-HT、NE、DA等神經遞質，還能通過調節腸道上皮細胞功能影響神經遞質的生成，神經遞質可能通過循環系統和迷走神經影響中樞神經遞質功能[31-32]。但遠志提取物改善HPA軸功能、增強神經遞質水平與菌群間的聯系需要進一步研究。

通過KEGG功能代謝途徑分析可知，遠志提取物主要影響脂質代謝、脂肪酸代謝和糖代謝等途徑，其中脂肪酸代謝途徑可能與遠志提取物增加抑郁大鼠腸道中能夠產生短鏈脂肪酸的菌群相對豐度有關。不飽和脂肪酸可通過影響多種神經遞質的傳遞過程改善海馬功能，對情緒變化和抑郁癥狀具有調節作用[33]。Zheng等[34]發現抑郁樣獼猴外周和中樞鞘脂代謝失調與腸道菌群相關。研究發現，糖代謝紊亂與抑郁癥相關。抑郁患者前額葉皮質葡萄糖代謝減少[35]；抑郁模型動物小腸吸收葡萄糖的能力下降[36]；抑郁大鼠骨骼肌的葡萄糖轉運和糖儲存功能被低血糖及胰島素抑制[37]；抑郁大鼠丘腦葡萄糖轉運體1和葡萄糖轉運體3表達降低[38]。

綜上所述，遠志提取物具有抗抑郁作用，能夠調節抑郁大鼠腸道內菌群結構，并能改善菌群失調引起的腸屏障功能損傷、LPS吸收入血量增加及其誘發的炎癥反應。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect ofextract on gut microbiota of depression rat

CHEN Qi-jun, YU Lan, ZHAO Wen-wen, XU Rong-rong, CHEN Xiao-qing, WU Xia, BA Yin-ying

Beijing Key Lab of TCM Collateral Disease Theory Research, School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China

To explore the effect and mechanism of Yuanzhi () extract on gut microbiota of depressed rats.Orphans and chronic unpredictable mild stress (CUMS) were used to establish depression rats model. SD rats were randomly divided into control group, control administration group, model group, fluoxetine (2 mg/kg) group and extract ofhigh-, medium- and low-dose (1.5, 1.0, 0.5 g/kg) groups. Behavior of rats in each group were observed and levels of monoamine neurotransmitters and their metabolites in hippocampus were detected; ELISA were used to detect levels of corticotropin-releasing factor (CRF), adrenocorticotropic hormone (ACTH), corticosterone (CORT), interleukin-6 (IL-6) and lipopolysaccharide (LPS) in serum of rats; Transmission electron microscopy (TEM) was used to observe ultrastructural changes of duodenum and colon epithelium of rats; 16S rRNA sequencing was used to detect structural changes of gut microbiota in feces of rats.Compared with model group, depression-like behaviors of rats inextract groups were significantly improved (< 0.05, 0.01, 0.001); Levels of norepinephrine (NE) and 5-hydroxytryptamine (5-HT), dihydroxyphenyl acetic acid (DOPAC) and 5-hydroxyindoleacetic acid (5-HIAA) in hippocampus were significantly increased (< 0.05, 0.01, 0.001); Levels of CRF, ACTH, CORT, IL-6 and LPS in serum were significantly reduced (< 0.01, 0.001), hyperfunction of hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis was alleviated;extract had a regulatory effect on imbalance of gut microbiota flora in rats.extract plays an antidepressant effect by improving structure of gut microbiota, restoring intestinal barrier function, reducing release of intestinal endotoxin and inhibiting inflammation.

extract; depression; chronic unpredictable mild stress; gut microbiota; 16S rRNA

R285.5

A

0253 - 2670(2021)08 - 2313 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.08.014

2020-10-23

國家自然科學基金青年基金項目（81703670）

陳啟軍（1994—），男，碩士研究生，研究方向為中藥藥效物質基礎研究。E-mail: qijun@ccmu.edu.cn

吳 霞，教授，博士生導師，研究方向為中藥藥效物質基礎與新藥研發。E-mail: wuxia6710@163.com

巴寅穎，副教授，碩士生導師，研究方向為中藥藥效物質基礎與新藥研發。E-mail: bayinying@ccmu.edu.cn

[責任編輯 李亞楠]