特發性肛門瘙癢癥患者直腸黏膜感覺受體表達情況研究

徐利，代群，何孝康，李敏

本研究背景：

雖然特發性肛門瘙癢癥為肛腸外科醫生與皮膚科醫生所熟悉，但其發病機制目前尚不明確。引起特發性肛門瘙癢癥的原因有很多，涉及糞便稀疏、糞便污濁、直腸肛門抑制反射過度導致肛門括約肌松弛等，這些廣泛但有時相互矛盾的病因學表明特發性肛門瘙癢癥的病因、病理生理機制復雜多樣。

本研究創新性及價值：

本研究采用免疫組化、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）對特發性肛門瘙癢癥患者直腸黏膜感覺受體進行定性檢測與定量分析，發現其瞬時感受器電位香草酸受體1（TRPV1）、5-羥色胺（5-HT）明顯升高，其直腸順應性降低、感覺閾值升高可能與TRPV1、5-HT的過表達有關，并可能是由于直腸黏膜感覺傳遞中遞質敏化或表型改變所致，這一推斷不僅可初步解釋特發性肛門瘙癢癥患者多伴有肛門潮濕、滲漏、墜脹感，瘙癢多在排便后或夜間加劇的原因，也為深入研究特發性肛門瘙癢癥的病理生理機制奠定了分子生物學基礎。

特發性肛門瘙癢癥是臨床常見肛周疾病之一，患者通常僅有肛周瘙癢癥狀而無特定病理因素。很多特發性肛門瘙癢癥患者經常抱怨糞便刺激后肛門瘙癢癥狀加重，同時盡管多數特發性肛門瘙癢癥患者肛門括約肌并未受到任何損傷，但仍有很多患者可能會出現肛門潮濕、肛門墜脹感等直腸感覺閾值異常現象及低擴張容積、低直腸順應性、直腸高壓等，進而引發直腸收縮。因此，導致特發性肛門瘙癢癥患者肛門潮濕、肛門墜脹感的原因除與肛管括約肌功能失調有關外，還可能與直腸黏膜感覺功能障礙有關。本研究旨在分析特發性肛門瘙癢癥患者直腸黏膜感覺受體表達情況，以探討肛門直腸感覺閾值異常與直腸黏膜感覺相關信號分子變化在特發性肛門瘙癢癥患者中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2017年1月—2019年6月浙江中醫藥大學附屬第一醫院肛腸外科與消化內科收治的門診及住院特發性肛門瘙癢癥患者30例作為瘙癢組，同期在浙江中醫藥大學附屬第一醫院體檢健康者29例作為健康組。受試前一周未服用任何藥物。特發性肛門瘙癢癥的診斷參照中華中醫藥學會制定的《中醫肛腸科常見病診療指南》［1］中的肛門瘙癢癥診斷標準，并伴有肛門潮濕。納入標準：（1）年齡19～64歲；（2）性別不限；（3）無消化系統或全身性疾病。排除標準：（1）有肛門直腸手術史；（2）伴有其他肛周疾病，如外痔、肛瘺、肛裂及炎癥性腸病相關肛周疾病等；（3）肛周皮膚疾病。本研究經浙江中醫藥大學附屬第一醫院審查通過（意見號：2017-b-155）。

1.2 標本采集 獲得兩組受試者知情同意后，采用直腸鏡采集其直腸黏膜組織，具體如下：（1）標本采集前囑兩組受試者使用開塞露以排空大便，并告知其在標本采集過程中會出現輕微疼痛和肛門墜脹感，且短期內可能會出現便血，但一般3～5 d會緩解；（2）采樣時囑患者取左側屈膝臥位，在直腸鏡表面涂抹石蠟油進行潤滑后將直腸鏡經肛門緩慢插入直腸腔內，然后緩慢退鏡并在直腸下段（距離齒狀線約3 cm）采用活檢鉗鉗夾直腸下段黏膜組織2～3塊；（3）將鉗取的直腸下段黏膜組織先分別置于4%甲醇溶液中進行固定、保存，再置于液氮進行急凍并在-80 ℃冰箱中保存。

1.3 試劑與儀器 RNA提取試劑盒（RNAiso Plus）及反轉錄、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）試劑盒購自TaKaRa生物股份有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其中瞬時感受器電位香草酸受體1（TRPV1）上游引物序列為5'-CATTGTGCAGATTGAGCAT-3'，下游引物序列為5'-TTCCTGCAGAAGAGCAAGAAGC-3'；5-羥色胺（5-HT） 上游引物序列為5'-TGATTTGCTGGTTGGATTGTTTG-3'， 下游引物序列為5'-ATGGATGCGGTTGAAAAGAGAA-3'；三磷酸腺苷受體受體P2X2抗體上游引物序列為5'-GCCTCTCCGACGCCGACTG-3'， 下游引物序列為5'-GGCCATCGTACCCAGAAATTG-3'； 甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）上游引物序列為5'-ATGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3'，下游引物序列為5'-CTGTFGAAGTCGCAGGAGACA-3'。 一抗：TRPV1（PTG，22686-1），5-HT（GeneTex，GTX31099），三磷酸腺苷受體受體P2X2抗體（GeneTex，GTX119003）；兔二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號：sp-90015）。顯色劑：二氨基聯苯胺（DAB）（北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號：ZLI-9018）。日本奧林巴斯BX51T-PHD-J11顯微鏡，北京離心機廠LDZ5型離心機，切片機（萊卡RM2235），美國ABI7900實時熒光定量PCR儀等。

1.4 方法

1.4.1 免疫組化 （1）采用磷酸鹽緩沖液（PBS）對鉗取的直腸下段黏膜組織進行沖洗，選取＜0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm的組織塊。（2）先采用4%多聚甲醛〔0.1 mol/L PBS，pH值為7.0～7.6，含0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）〕進行固定，再采用70%、90%、80%、100%乙醇進行洗滌、脫水，最后進行浸蠟、包埋。（3）采用切片機進行切片，切片厚度為5 μm。（4）將切片附于經多聚賴氨酸附膜的載玻片上，過夜后進行脫蠟、入水及梯度乙醇浸泡，依次進行自來水沖洗、PBS沖洗。（5）抗原修復：滴加正常山羊血清封閉液后分別滴加按比例稀釋（1∶1 000）的一抗，過夜后滴加生物素化二抗（IgG）。（6）采用PBS進行沖洗，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，再次采用PBS沖洗后加入DAB以顯色，蘇木素復染細胞核1 min。（7）充分水洗后采用中性樹脂封片。（8）采用顯微鏡（×400）進行觀察并選擇兩組受試者陽性和陰性標本相進行顯微照相、圖像分析及HIS評分，其中顯微鏡下細胞核呈藍色、細胞質呈深淺不一的棕色為陽性表達，否則為陰性表達；圖像分析采用Image軟件，并自動計算平均光密度值（MOD值）；HIS評分為陽性細胞數評分（陽性范圍0～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，76%～100%計4分）與陽性細胞顯色強度評分（陰性計0分，淡黃色計1分，淺褐色計2分，深褐色計3分）的乘積。

1.4.2 實時熒光定量PCR 采用Trizol法提取兩組受試者直腸下段黏膜組織總RNA，采用核酸儀測定其濃度并按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄出cDNA，95 ℃預變性5 min后，95 ℃變性15 s→60 ℃變性40 s（40個循環）；經PCR擴增后采用實時熒光定量PCR儀自帶軟件ABI Prism 7500 SDS Software分析TRPV1、5-TH、三磷酸腺苷受體受體P2X2抗體mRNA表達情況：（1）根據陰性對照調整閾值和基線以確定各標本Ct值，并根據熔解曲線確定該Ct值是否有效；（2）采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量，其中ΔΔCt=ΔCt樣本均值-ΔCt陰性對照均值，ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件包進行數據分析，符合正態分布的計量資料以（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2.2 兩組患者治療前、后雙側卵巢AFC數比較 治療前兩組患者AFC數比較差異無統計學意義(P>0.05)；治療后兩組患者AFC數高于治療前，且觀察組高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2 結果

免疫組化結果顯示，瘙癢組患者直腸黏膜組織TRPV1、5-HT呈陽性表達，三磷酸腺苷受體受體P2X2抗體呈陰性表達（見圖1）。瘙癢組患者TRPV1 MOD值（t=8.233）及HIS評分（t=22.370）、5-HT MOD值（t=8.249）及HIS評分（t=5.980）高于健康組，差異有統計學意義（P＜0.01），而兩組受試者直腸黏膜組織三磷酸腺苷受體受體P2X2抗體MOD值（t=1.488）及HIS評分（t=1.303）比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見圖 2～3）。

圖1 兩組受試者直腸黏膜組織TRPV1、5-HT、三磷酸腺苷受體受體P2X2抗體表達情況（免疫組化，×400）Figure 1 The expression of TRPV1，5-HT and P2X2 in rectal mucosal tissue in pruritus and healthy groups

圖2 兩組受試者直腸黏膜組織TRPV1、5-HT、三磷酸腺苷受體受體P2X2抗體MOD值比較Figure 2 Comparison of the MOD value of TRPV1，5-HT and P2RX2 polyclonal antibody in rectal mucosal tissue between pruritus and healthy groups

圖3 兩組受試者直腸黏膜組織TRPV1、5-HT、三磷酸腺苷受體受體P2X2抗體HIS評分比較Figure 3 Comparison of the HIS score of TRPV1，5-HT and P2RX2 polyclonal antibody in rectal mucosal tissue between pruritus and healthy groups

實時熒光定量PCR結果顯示，瘙癢組患者直腸黏膜組織TRPV1、5-HT mRNA相對表達量高于健康組，差異有統計學意義（t值分別為7.306、8.144，P＜0.01），而兩組受試者直腸黏膜組織三磷酸腺苷受體受體P2X2抗體mRNA相對表達量比較，差異無統計學意義（t=0.457，P＞0.05，見圖4）。

圖4 兩組受試者直腸黏膜組織TRPV1、5-HT、三磷酸腺苷受體受體P2X2抗體mRNA相對表達量比較Figure 4 Comparison of the relative expression quantity of mRNA of TRPV1，5-HT and P2RX2 polyclonal antibody in rectal mucosal tissue between pruritus and healthy groups

3 討論

目前，關于特發性肛門瘙癢癥病因學的嚴格的、系統性的研究很少見，多數研究者從細菌學角度考慮特發性肛門瘙癢癥的主要病因。早期研究表明，特發性肛門瘙癢癥患者會出現過度的直腸肛門抑制反射并導致肛管滲漏發生風險升高［2］，因此推測特發性肛門瘙癢癥患者直腸感覺閾值異常主要由內臟感覺傳遞神經敏化或表型改變所致，但是何種原因導致了直腸感覺功能障礙，直腸感覺閾值異常是否與直腸黏膜相關感覺信號分子表達有關？本研究以直腸黏膜感覺受體為切入點，比較了特發性肛門瘙癢癥患者與體檢健康者直腸黏膜TRPV1、5-HT、三磷酸腺苷受體受體P2X2抗體表達情況。

3.1 TRPV1 TRPV1是當前許多胃腸道疾病研究的“明星”分子，與許多胃腸道疾病的病理生理機制及治療密切相關：TRPV1敏感傳入神經激活對小鼠遠端結腸和直腸擴張后內臟運動反應（VMR）的傳遞至關重要，在內臟反應中已有通過改變表達、增強或降低激活閾值來調節TRPV1功能的描述［3］；攝入TRPV1拮抗劑5周可有效減輕功能性消化不良志愿者內臟疼痛，但有明顯不良反應［4］；TRPV1通道參與結腸高敏反應相關疾病，腸易激綜合征（IBS）患者結腸黏膜TRPV1表達升高，但TRPV1的表達在IBS亞組〔混合型IBS（IBS-M）、IBS腹瀉型（IBS-D）、BS便秘型（IBS-C）〕間并無統計學差異，提示TRPV1表達升高與IBS患者內臟高敏性相關［5］。BRIERLEY等［6］進行的小鼠體外實驗證明，辣椒素直接激活了61%的腰內臟神經（LSN）傳入纖維和47%的骶盆腔神經（PN）傳入纖維，82%的胸腰和50%的腰骶結腸不同大小背根節（DRG）神經元顯示瞬時受體樣免疫樣反應（TRPV1-like immunoreactivity，TRPV1-LI），PN的配對終止于腰骶脊髓并主要支配直腸感覺信號的傳導，這些不同的受體表達譜意味著遠端結腸和直腸區域對香草或嘌呤能刺激的化學敏感性略低于遠端結腸近端區域。由上述可知，TRPV1在遠端結腸和直腸敏感性、腸道動力調節方面均具有重要作用。

CHAN等［7］通過對30例健康志愿者直腸黏膜組織進行活檢發現，其平均直腸熱感覺閾值與排便欲望、最大耐受量密切相關，靜脈注射辣椒素后其直腸產生劑量依賴的感覺，提示直腸黏膜組織存在高密度功能性TRPV1，而TRPV1能感受腸腔內各種刺激。本研究結果顯示，瘙癢組患者直腸黏膜組織TRPV1 MOD值、HIS評分及mRNA相對表達量均高于健康組，提示特發性肛門瘙癢癥患者直腸感覺閾值增高、直腸順應性降低與TRPV1表達增高有關。需要指出的是，雖然目前有多項關于TRPV1在內臟高敏性結直腸動力紊亂性疾病中的機制研究，但關于特發性肛門瘙癢癥患者直腸黏膜組織TRPV1表達情況的研究報道較少見，且很多有爭議的治療效果和病理生理機制還需要進一步驗證，因此推測特發性肛門瘙癢癥患者可能存在傳入神經敏化，或可能僅通過增加纖維密度而引起機械或熱閾值降低，繼而導致肛門瘙癢感覺增強。

3.2 5-HT 5-HT是腸道中重要的信號分子，在腸道感覺傳導和腸道動力調節方面發揮著重要作用。研究表明，5-HT具有調節腸道運動分泌與黏膜感覺的作用，腸道5-HT的表達減少可導致腸道蠕動功能減弱及便秘，而5-HT過表達則可導致直腸感覺、運動過敏，造成便意頻繁、肛門墜脹、排便不盡感等直腸高敏反應；腸嗜鉻細胞是壓力傳感器，可將5-HT分泌到腸壁中，刺激黏膜下主要傳入神經元而引起蠕動反射［8］；腸內5-HT在感覺傳導中具有重要作用，可激活結腸黏膜內固有初級傳入神經元和外在初級傳入神經元末端［9］，而結腸黏膜5-HT主要受色氨酸氫化酶1（TPH-1）和轉運蛋白（SERT）調控。MATSUMOTO等［10］通過建立葡聚糖硫酸酯鈉（DSS）小鼠結腸炎模型發現，小鼠直腸黏膜神經元/非神經元TRPV1通道激活，5-HT3受體表達增加，5-HT4受體表達減少，TRPV1拮抗劑和5-HT3受體拮抗劑可使內臟痛覺過敏減輕至正常對照組水平，提示腸黏膜TRPV1通道和5-HT信號改變可能是導致結腸炎小鼠內臟高敏反應的原因之一，而內臟高敏狀態與初級傳入神經纖維的高敏反應相關。

本研究結果顯示，瘙癢組患者直腸黏膜組織5-HT MOD值、HIS評分及mRNA相對表達量高于健康組，提示特發性肛門瘙癢癥直腸感覺閾值異常可能與5-HT表達升高有關。由于5-HT可刺激直腸分泌、調節直腸收縮運動并導致直腸感覺閾值升高，而特發性肛門瘙癢癥患者直腸容量增加、直腸壁反射性壓力及直腸順應性下降，因此特發性肛門瘙癢癥患者肛門潮濕、滲漏除與短暫性括約肌松弛引起的括約肌功能失調有關外，還與5-HT的過表達導致直腸感覺閾值異常相關，進一步深入了解5-HT在腸道中的合成、分布、儲存、釋放及其對腸道感覺、運動的調控機制對治療特發性肛門瘙癢癥具有重要意義。

3.3 三磷酸腺苷受體受體P2X2抗體 三磷酸腺苷受體受體P2X2抗體廣泛分布于胃腸道，參與多種胃腸道疾病的發病，并與多種腸道功能障礙性疾病密切相關。同時，胃腸道運動神經元與感覺神經元中均有三磷酸腺苷受體受體P2X2抗體的表達，說明其與胃腸道運動和感覺功能均有密切聯系。吳璐一等［11］通過電針刺激IBS大鼠天樞穴、上巨虛穴發現，電針刺激能降低IBS內臟痛大鼠結腸肌間神經叢神經元三磷酸腺苷受體受體P2X2抗體的表達。DEVRIES等［12］通過評估野生型（WT）、三磷酸腺苷受體受體P2X2抗體和三磷酸腺苷受體受體P2X3抗體亞基敲除（KO）小鼠體內外結腸運動能力發現，煙堿受體主要分布于供給小鼠結腸縱肌的抑制性運動神經元，且包含三磷酸腺苷受體受體P2X2抗體或三磷酸腺苷受體受體P2X3抗體亞基的受體并不局限于供應縱向肌肉的運動神經元，因此由包含三磷酸腺苷受體受體P2X2抗體或三磷酸腺苷受體受體P2X3抗體亞基的受體介導的突觸傳遞對于小鼠結腸的運動性并不是必需的。OHMAN等［13］通過對初生大鼠結腸注射乙酸而誘導內臟高敏反應，發現其嘌呤類受體（P2XR）的表達會大幅度增加以維持內臟高敏性，慢性功能性內臟痛覺過敏與三磷酸腺苷（ATP）誘發的反應增強和結腸特異性感覺神經元三磷酸腺苷受體單體（P2X3Rs）的表達升高有關。以上研究一定程度上揭示了功能性結腸高敏反應的特定分子機制，可能為開辟IBS及相關疾病的新治療策略鋪平道路。

WYNN等［14］采用1種新型大鼠離體結腸直腸抑制劑研究腸擴張時黏膜是否釋放5-三磷酸腺苷，并評價其對直腸擴張時感覺神經放電的影響，結果發現三磷酸腺苷受體受體P2X3抗體在供應大鼠結腸直腸的背根神經節L1和S1神經元亞群中表達，結直腸擴張導致結腸上皮細胞釋放的5-三磷酸腺苷壓力依賴性增加，并引起盆腔神經興奮。目前，關于三磷酸腺苷受體受體P2X2抗體的表達情況及可能的調控機制研究主要集中于動物模型，關于人三磷酸腺苷受體受體P2X2抗體調控機制的研究主要集中于IBS這一消化道功能性疾病，但三磷酸腺苷受體受體P2X2抗體作為一種腸道擴張感覺信號傳導分子，是否參與了特發性肛門瘙癢癥患者直腸順應性降低及直腸感覺閾值增強仍是一個具有爭議性的問題。本研究結果顯示，兩組受試者直腸黏膜三磷酸腺苷受體受體P2X2抗體MOD值、HIS評分及mRNA相對表達量間均無統計學差異，因此三磷酸腺苷受體受體P2X2抗體是否未參與直腸感覺閾值異常，或由于直腸順應性降低、直腸擴張反應而未導致興奮傳導，或因為本研究樣本量較小？這些均需進一步研究證實。

內臟高敏感狀態指機體空腔臟器對有害刺激產生的過激反應和對生理刺激產生的不適感，與各種離子通道的激活、中樞神經致敏性、外周神經致敏性、直腸順應性降低均相關，發病機制復雜。直腸高敏感狀態屬于內臟高敏狀態，與直腸腸壁感覺功能相關，多種直腸高敏性直腸疾病患者均存在TPRV1、5-HT表達升高，如功能性腸病IBS、直腸炎（包括放療后直腸炎）、直腸前切除術后綜合征等。筆者所在課題組前期研究發現，TRPV1在辣椒素誘導的肛門瘙癢模型小鼠肛門皮膚中的表達明顯升高，而通過溫和灸治療后TRPV1的表達明顯減少，提示TRPV1通路的異常激活是特發性肛門瘙癢癥的發病機制之一［15］；與正常人和便秘患者相比，特發性肛門瘙癢癥患者直腸順應性降低但直腸敏感性增加，同時特發性肛門瘙癢癥患者直腸黏膜感覺受體TRPV1、5-HT的表達異常升高，因此推斷特發性肛門瘙癢癥患者直腸感覺閾值升高及直腸順應性降低可能與直腸黏膜TRPV1、5-HT的表達升高有關，且TRPV1、5-HT的表達可能是由于直腸黏膜感覺傳遞中遞質敏化或表型改變所致［16］。

綜上所述，特發性肛門瘙癢癥患者直腸黏膜感覺受體TRPV1、5-HT的表達明顯升高，其直腸順應性降低、感覺閾值升高可能與TRPV1、5-HT的過表達有關，并可能是由于直腸黏膜感覺傳遞中遞質敏化或表型改變所致，但直腸黏膜感覺受體對直腸感覺與運動功能的調控是一個復雜的病理生理過程，本推斷還需要謹慎地進一步研究。

作者貢獻：徐利進行研究的構思、設計及可行性分析，撰寫論文并對文章整體負責；代群負責指導試驗技術操作等；何孝康進行文獻資料收集及整理、數據分析；李敏負責論文的修訂。

本文無利益沖突。