熟地黃酒燉法炮制工藝研究

梁志毅，徐 杰，程學(xué)仁，黃夢婷，張志鵬，魯 云

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244)

熟地黃是由玄參科植物地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)干燥的塊根經(jīng)加工炮制而成，味甘，性微溫，具有補血滋陰、益精填髓的功效[1]。歷史上熟地黃的炮制方法各異，其中以“九蒸九曬”最為常見[2]。由于傳統(tǒng)加工工藝繁瑣，耗時耗能，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，近現(xiàn)代熟地黃的炮制多以“清蒸”和“酒燉”為主。

唐慎微的《證類本草》[3]中“光黑如漆，味甘如飴”的描述作為熟地黃質(zhì)量評價的標(biāo)準(zhǔn)一直從宋代沿用至今，但僅憑感官判定結(jié)果作為藥材質(zhì)量評價指標(biāo)，缺乏科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)性，難以實現(xiàn)熟地黃炮制的現(xiàn)代化和標(biāo)準(zhǔn)化。研究表明，熟地黃的炮制過程中，指標(biāo)成分毛蕊花糖苷的含量會逐漸降低；同時由于“美拉德反應(yīng)”會逐漸產(chǎn)生糖衍生物5-羥甲基糠醛，其與熟地黃在炮制過程中變黑密切相關(guān)[4-7]。

《中國藥典》2015版一部對熟地黃炮制項下酒燉法的具體燉制時間、黃酒用量、炮制終點等均未作詳盡的說明，缺乏量化指標(biāo)，不利于熟地黃的質(zhì)量控制。既要保證熟地黃的充分熟化，達(dá)到“黑如漆，甘如飴”的感官標(biāo)準(zhǔn)，又要防止燉制時間過長導(dǎo)致指標(biāo)成分的過度損失，炮制過程尤為關(guān)鍵。因此，本研究參考“德爾菲法”[8]在藥材商品規(guī)格評價上的應(yīng)用，對酒燉法炮制所得熟地黃進(jìn)行性狀評價，同時結(jié)合加權(quán)法，以性狀評價和毛蕊花糖苷、5-羥甲基糠醛及水溶性浸出物的含量為指標(biāo)進(jìn)行綜合評分，采用正交試驗優(yōu)化熟地黃的酒燉法炮制工藝，以期優(yōu)選出質(zhì)量接近傳統(tǒng)工藝且適用于現(xiàn)代化生產(chǎn)的酒燉法炮制工藝參數(shù)，為熟地黃質(zhì)量控制研究提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。

1 材料與儀器

生地黃購自民生藥業(yè)集團(tuán)豫西中藥材物料基地有限公司，經(jīng)廣東一方制藥有限公司質(zhì)量中心鑒定為玄參科植物地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)干燥的塊根。毛蕊花糖苷(批號111530-201713，純度92.5%)、5-羥甲基糠醛(批號111626-201711，純度99.4%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；紹興黃酒(紹興柯橋第三酒廠)；色譜級甲醇、乙腈(德國默克股份兩合公司)；色譜純醋酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水，其余試劑均為分析純。

Waters Arc型高效液相色譜儀(包括真空脫氣機、二元梯度泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、TUV 檢測器、Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國Waters公司)；MiliQ Direct 8型超純水機(德國默克密理博公司)；111B型二兩裝高速中藥粉碎機(浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司)；ME203E型分析天平(美國METTLER TOLEDO公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 毛蕊花糖苷含量測定[1]

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%醋酸水溶液(16 ∶ 84)；流速為1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長334 nm；進(jìn)樣量20 μL。色譜如圖1所示。

圖1 毛蕊花糖苷對照品(A)、熟地黃樣品(B)的HPLC色譜

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊花糖苷對照品適量于25 mL容量瓶中，用流動相溶解并定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為36.93 μg·mL-1的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取熟地黃樣品粉末約2.0 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇100 mL，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液50 mL，減壓回收溶劑近干，殘渣用流動相溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加流動相定容至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取毛蕊花糖苷對照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，以“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(x)，得線性回歸方程y=63 864x-3 995(R2=1.000 0)，線性范圍為0.037～0.739 μg。

2.2 5-羥甲基糠醛含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水(5 ∶95)；流速為1.0 mL·min-1；柱溫35 ℃；檢測波長280 nm；進(jìn)樣量10 μL。色譜如圖2所示。

圖2 5-羥甲基糠醛對照品(C)、熟地黃樣品(D)的HPLC色譜

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取5-羥甲基糠醛對照品適量于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為50.30 μg·mL-1的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取熟地黃樣品粉末約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%甲醇50 mL稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)2 h，放冷，再稱定重量，用30%甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取5-羥甲基糠醛對照品溶液1、2、3、5、8、10 μL，以“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(x)，得線性回歸方程y=235 566x-16 701(R2=0.999 9)，線性范圍為0.050～0.503 μg。

2.2.5 精密度考察 取正交試驗3號熟地黃樣品供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計算5-羥甲基糠醛峰面積積分值的RSD為0.22%，說明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性考察 取正交試驗3號熟地黃樣品供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣檢測，結(jié)果5-羥甲基糠醛峰面積積分值的RSD為2.30%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性考察 取正交試驗3號熟地黃樣品，按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，分別進(jìn)樣檢測，結(jié)果5-羥甲基糠醛含量的RSD為0.98%，說明方法的重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取正交試驗3號熟地黃樣品，精密稱取0.5 g，平行6份，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入一定量的 5-羥甲基糠醛對照品后，按供試品溶液制備方法處理并測定含量，計算加樣回收率，結(jié)果5-羥甲基糠醛的平均加樣回收率為96.90%，RSD為2.40%，說明回收率良好。結(jié)果見表1。

表1 5-羥甲基糠醛加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)

2.3 水溶性浸出物含量測定

參照2015年版《中國藥典》(四部)附錄項下(2201)水溶性浸出物含量測定方法(冷浸法)測定。

2.4 正交試驗優(yōu)化熟地黃酒燉法炮制工藝

2.4.1 正交試驗因素與水平 選擇以悶潤時間(A)、黃酒用量(B)、燉制時間(C)為考察因素，各因素設(shè)計3個水平，采用L9(34)進(jìn)行正交設(shè)計。因素水平見表2。

表2 正交試驗因素與水平

2.4.2 熟地黃性狀評分 本研究在對熟地黃傳統(tǒng)“光黑如漆，味甘如飴”的感官評價基礎(chǔ)上，選擇外觀性狀、斷面特征、氣味、味道4種指標(biāo)，以《中國藥典》2015版規(guī)定的熟地黃外觀性狀“表面烏黑色、有光澤、黏性大，斷面烏黑色、有光澤，氣微，味甜”為10分標(biāo)準(zhǔn)，參照“德爾菲法”對正交試驗得到的熟地黃外觀性狀進(jìn)行評價(評測小組成員由3名主管中藥師和3名執(zhí)業(yè)中藥師組成；評測方式以自評式“盲法”評價與集中會評相結(jié)合)，計算均值；根據(jù)各感官指標(biāo)在熟地黃性狀鑒別中的穩(wěn)定性和可區(qū)分性，給予不同的加權(quán)系數(shù)，對熟地黃性狀進(jìn)行綜合評分(綜合評分=外觀性狀/8.4×4+斷面特征/9.2×4+氣味/9.4×1+味道/9.0×1)，結(jié)果見表4。

表4 熟地黃性狀評分

2.4.3 正交試驗結(jié)果分析 根據(jù)正交表炮制得到1～9號熟地黃樣品，按照“2.1”“2.2”及“2.3”項下方法，分別測定各樣品毛蕊花糖苷、5-羥甲基糠醛以及水溶性浸出物的含量，根據(jù)各指標(biāo)在熟地黃炮制工藝選擇中的地位，給予不同的加權(quán)系數(shù)，即性狀評分占權(quán)重的20%，毛蕊花糖苷的含量占權(quán)重的30%，5-羥甲基糠醛的含量占權(quán)重的30%，水溶性浸出物含量占權(quán)重的20%。求出綜合評分(綜合評分=性狀評分/10×20+毛蕊花糖苷/0.064%×30+5-羥甲基糠醛/0.141%×30+浸出物含量/82.77%×20)，以綜合評分值對正交試驗結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析。

直觀分析結(jié)果表明，熟地黃酒燉法炮制工藝最佳條件應(yīng)為A1B3C3,，即取100 g生地黃，加50 g的黃酒，隔水燉制8 h。方差分析結(jié)果表明，以毛蕊花糖苷、5-羥甲基糠醛、水溶性浸出物的含量為指標(biāo)進(jìn)行綜合評分時，方差大小為C>A>B，說明蒸制時間對熟地黃中相關(guān)指標(biāo)含量的影響最大，其次是悶潤時間和黃酒用量，結(jié)果見表5～表6。

表5 正交試驗綜合加權(quán)評分結(jié)果

表6 方差分析結(jié)果

2.5 炮制工藝驗證

稱取生地黃藥材200 g，平行3份，以正交試驗結(jié)果評分最高的方法進(jìn)行炮制，按照“2.1”“2.2”“2.3”以及“2.4.2”項下方法，分別測定各樣品毛蕊花糖苷、5-羥甲基糠醛、水溶性浸出物的含量，并進(jìn)行性狀評分，驗證實驗結(jié)果的可靠性，結(jié)果3次驗證試驗炮制所得熟地黃綜合評分均值為86.12，RSD=4.33%<5%，表明優(yōu)化的酒燉法炮制工藝條件合理，穩(wěn)定可行。結(jié)果詳見表7。

表7 熟地黃酒燉法炮制工藝驗證 (n=3)

3 討論

傳統(tǒng)熟地黃“九蒸九曬”的炮制方法操作繁雜、費時耗力，“光黑如漆，味甘如飴”的感官評判標(biāo)準(zhǔn)難以界定；現(xiàn)行版《中國藥典》對酒燉法炮制熟地黃的悶潤時間、輔料用量、蒸制時間等均未有詳細(xì)規(guī)定，導(dǎo)致市售熟地黃質(zhì)量參差不齊。作為大宗常用中藥材，熟地黃市場需求量大，部分藥材銷售商為追求利益最大化，或是縮短蒸制時間增大產(chǎn)能，或是減少黃酒用量降低成本，長此以往，嚴(yán)重影響了熟地黃臨床用藥的安全性和有效性[9]。近年來，已有諸多關(guān)于熟地黃“蒸法”炮制工藝的研究報道[10-15]，但尚未有文獻(xiàn)結(jié)合熟地黃的性狀和化學(xué)成分，針對《中國藥典》規(guī)定的酒燉法進(jìn)行炮制工藝的優(yōu)化探索。

本研究參照“德爾菲法”在中藥材商品規(guī)格評價上的應(yīng)用，結(jié)合加權(quán)法，對正交試驗設(shè)計炮制所得熟地黃的性狀進(jìn)行綜合評分，使優(yōu)化后的酒燉法炮制工藝所得熟地黃能夠滿足傳統(tǒng)“光黑如漆，味甘如飴”的感官標(biāo)準(zhǔn)；優(yōu)選的酒燉法炮制工藝所得熟地黃毛蕊花糖苷和水溶性浸出物的含量均遠(yuǎn)高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，5-羥甲基糠醛的含量適中，達(dá)到《大韓藥典》規(guī)定“以干品定量時5-HMF含量應(yīng)大于 0.1%”的限度[16]。經(jīng)過3批工藝驗證試驗證明，基于多指標(biāo)綜合評分-正交試驗法優(yōu)化的酒燉法工藝合理、穩(wěn)定可行，可以為熟地黃現(xiàn)代化炮制生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。當(dāng)然，僅以毛蕊花糖苷和5-羥甲基糠醛作為熟地黃質(zhì)量控制的指標(biāo)成分，存在一定的局限性。研究表明，5-羥甲基糠醛具有神經(jīng)毒性，過量可能與人體蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生積蓄中毒，對人體橫紋肌及內(nèi)臟造成損害[17]，因此熟地黃炮制過程中5-羥甲基糠醛的限量有待確定。環(huán)烯醚萜類、還原糖類成分在炮制過程中的含量變化以及《中國藥典》規(guī)定熟地黃炮制項下“酒燉法”與“蒸法”存在的差異性有待深入研究。