附子不同炮制品對(duì)陽(yáng)虛小鼠免疫功能的影響

沈玉巧，林 華*，鄧廣海，陳丹丹，劉瑤玉，周 威

(1.廣東省中醫(yī)院 藥學(xué)部，廣東 廣州 510120；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510380)

附子為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliDebx.子根的加工品，具有回陽(yáng)救逆、散寒止痛之功效[1]。附子中的主要化學(xué)成分為生物堿，此外還含有多糖、黃酮類、皂苷類、植物甾醇等。其中附子多糖不僅能增強(qiáng)細(xì)胞免疫還能增強(qiáng)體液免疫，在抗腫瘤、抗氧化等方面均有較好的作用[2]。附子的傳統(tǒng)炮制工藝往往以減毒為主，因此常有炮制品的毒性雖然很小，但有效成分含量偏低的現(xiàn)象[2]，發(fā)揮不了功效。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了高溫、高壓、微波三種新型炮制工藝，結(jié)合傳統(tǒng)炮制工藝，對(duì)炮制品煎煮液的6種主要單雙酯型生物堿含量進(jìn)行了測(cè)定[1]，同時(shí)對(duì)4種炮制品對(duì)于陽(yáng)虛小鼠免疫器官的影響進(jìn)行比較，為附子新型炮制工藝的推廣與應(yīng)用提供藥理學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與設(shè)備

1.1 動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物均為SPF級(jí) KM種小鼠，雌、雄各半，體質(zhì)量約20 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(小鼠合格證號(hào)：44007200012065)。

1.2 儀器與試藥

AUY220型分析天平(日本島津)、Agilent-1200型HPLC、RV 10basic V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(IKA)。附子藥材(批號(hào)：20130812，產(chǎn)地：四川江油)由康美藥業(yè)四川江油分公司提供，經(jīng)廣東省中醫(yī)院藥劑科主任中藥師鑒定為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliDebx．的子根；微波炮制品、黑順片、高溫炮制品、高壓炮制品均由實(shí)驗(yàn)室按照統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)條件通過同一批原藥材制得。乙腈、四氫呋喃為色譜級(jí)純；注射用氫化可的松琥珀酸鈉(批號(hào)：201308011，煙臺(tái)北方制藥有限公司)；水合氯醛為分析純。

2 方法

2.1 炮制工藝

2.1.1 黑順片[1]按照藥典要求進(jìn)行炮制。

2.1.2 高壓炮制片[4]取附子生品2 kg，洗凈后噴灑膽巴水適量，蓋上用膽巴水沾濕的濕布悶潤(rùn)30 min，設(shè)置壓力為0.1 MPa蒸制150 min，切薄片于50 ℃烘干去除碎屑即得。

2.1.3 高溫烘制片[5]取附子生品2 kg，每天按時(shí)更換膽巴水，泡至內(nèi)無白心，切薄片于烘箱120 ℃烘制12 h，去除碎屑即得。

2.1.4 微波炮制片[6]取附子生品2 kg，噴灑膽巴水適量，蓋上用膽巴水沾濕的濕布至透心，切薄片放入格蘭仕微波爐中，中火炮制25 min即得。

2.2 煎煮液的制備及含量測(cè)定

取附子各炮制品1 000 g加入陶瓷煎鍋中，先加10倍量水浸泡30 min后，武火至沸，再文火煎煮1 h，過濾，藥渣加8倍量的水煮沸后再煎煮30 min，合并2次煎煮液。真空減壓加熱濃縮至0.75 g/kg、1.50 g/kg、4.50 g/kg；置于冰箱冷藏室保存。取煎煮液各10 mL，以3 000 r·min-1離心10 min，取上清液置橢圓形旋轉(zhuǎn)燒瓶中，40 ℃減壓回收溶劑至干，向瓶中加入鹽酸-甲醇(0.05%)溶液2 mL溶解，過0.45 μm微孔濾膜即得。通過HPLC測(cè)得生品及炮制品以及炮制品煎煮液的生物堿含量。

2.3 對(duì)陽(yáng)虛小鼠免疫器官的影響

取合格的SPF級(jí)KM小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為模型組、空白組、4種炮制品組(包括0.75 g/kg、1.50 g/kg、4.50 g/kg三種濃度)，共14組，每組8只。參照文獻(xiàn)方法[7]，模型組及各給藥組小鼠每日灌胃給予氫化可的松琥珀酸鈉溶液1 mg/只/天，空白組小鼠每日給予同體積生理鹽水，連續(xù)造模9天。第10天開始，空白組和模型組灌胃給予蒸餾水0.2 mL/10 g，給藥組按照附子不同炮制品給藥劑量0.2 mL/10g進(jìn)行灌胃給藥，連續(xù)給藥6天。于第11、13、15天灌胃給藥后，給藥組及模型組繼續(xù)給予造模給藥。于第1、5、9、10、12、15天對(duì)各組小鼠進(jìn)行稱重。末次給藥后24 h，斷頭處死。立即取各組小鼠的脾臟、胸腺，0.9%的生理鹽水漂洗干凈，濾紙吸干后稱重，計(jì)算脾臟、胸腺的質(zhì)量指數(shù)。

2.4 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 附子生品及不同炮制品生物堿含量

測(cè)得附子生品和4種炮制品以及4種炮制品煎煮液的主要生物堿含量見表1、表2。由表1及表2可知，附子高壓炮制品及其煎煮液的單酯型生物堿含量最高，雙酯型生物堿含量最低；炮制品生物堿含量均在2015版藥典的限量范圍內(nèi)。

表1 附子生品及不同炮制品生物堿含量 (mg/g)

表2 附子不同炮制品煎煮液的生物堿含量 (mg/g)

3.2 各組小鼠體質(zhì)量隨時(shí)間變化趨勢(shì)

通過SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，造模9天后模型組及各給藥組小鼠體質(zhì)量與空白組小鼠體質(zhì)量比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，說明本次實(shí)驗(yàn)造模是成功的。由圖1、圖2、圖3四種炮制品的高、中、低三種給藥濃度的體質(zhì)量增長(zhǎng)趨勢(shì)圖可知，4種給藥組小鼠體質(zhì)量增加幅度均較模型組變大，但無明顯差異(P>0.05)；同時(shí)高壓片組的體質(zhì)量增長(zhǎng)幅度略高于其他3組。

圖1 小鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì)(0.75 g/kg劑量組)

圖2 小鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì)(1.50 g/kg劑量組)

圖3 小鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì)(4.50 g/kg劑量組)

3.3 附子不同炮制品對(duì)陽(yáng)虛小鼠免疫器官的影響

由表3可知，模型組與空白組相比，小鼠的胸腺及脾臟指數(shù)出現(xiàn)較大幅度的下降(P<0.05)；與模型組相比，隨著給藥濃度的增加，附子4種炮制品組脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)較模型組均有所增加。同時(shí)在給藥濃度為4.50 g/kg時(shí)，各炮制品組與模型組相比存在顯著性差異(P<0.05)，說明附子炮制品均能提高陽(yáng)虛小鼠的免疫器官質(zhì)量指數(shù)；且隨著給藥濃度的增加，對(duì)免疫功能的提高作用成正相關(guān)，臟器指數(shù)的增加能夠反映免疫功能的提高[8]。附子4種炮制品組在相同給藥濃度的條件下，對(duì)陽(yáng)虛小鼠免疫器官質(zhì)量指數(shù)的提高無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表3 附子不同炮制品的小鼠胸腺、脾臟質(zhì)量指數(shù)

4 討論

附子傳統(tǒng)的炮制工藝為了降低毒副作用，首先要通過長(zhǎng)時(shí)間的膽巴水浸泡、再通過蒸煮等方法進(jìn)行炮制加工，毒副作用降低的同時(shí)生物堿類成分損失嚴(yán)重，而且炮制過程復(fù)雜耗時(shí)。本文通過對(duì)高溫烘制、高壓蒸制、微波炮制與傳統(tǒng)炮制的附子進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)高壓蒸制片的生物堿能夠得到較好的保存，同時(shí)對(duì)陽(yáng)虛小鼠的體質(zhì)量及免疫功能的提高也較好。至于高壓蒸制工藝能否取代傳統(tǒng)炮制工藝還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)支持與完善。