茵陳蒿湯合五苓散加減方對正常小鼠肝組織內細胞因子IL-6、IL-18表達的影響

周海東，玉藍青，鐘煥銘，農光任，潘朝杰，羅昊翔

(右江民族醫學院，廣西 百色 533000)

肝癌是常見的惡性腫瘤，據統計，2012年全球和中國肝癌發病總數占癌癥總數的5.6%和12.9%，2013年我國死于肝癌的患者為31.6萬人[1]，嚴重危害人民健康。目前對于肝癌的治療主要有手術切除、動脈栓塞等方法，但這些方法在臨床治療中均有一定的副作用，包括惡心、乏力等。曾有不少使用中藥方治愈肝癌的報道，如廣州中醫藥大學周岱翰教授曾使用茵陳蒿湯合五苓散加減辨證施治治療肝癌1例，存活10年以上[2]。研究表明，茵陳蒿湯及其加減方具有護肝、利膽、抗腫瘤作用，但茵陳蒿湯合五苓散加減方對肝癌的治療機制尚不清楚，是否與中藥方劑調節了體內某些分子的變化有關，目前對此知之甚少。本研究通過使用廣州中醫藥大學周岱翰教授治療肝癌的方劑茵陳蒿湯合五苓散加減方，熬制湯藥，對正常小鼠灌胃，觀察實驗組和對照組小鼠肝組織內細胞因子IL-6、IL-18的表達，為中藥方劑對體內微環境的調節尋找證據，為中醫藥在臨床治療腫瘤提供分子依據。

1 實驗材料與儀器

1.1 試劑

中藥購買于百色市一心堂藥店，兔抗鼠anti-IL-6、anti-IL-18(武漢博士德生物公司)，免疫組化試劑盒(武漢博士德生物公司，SA2022)，二甲苯、無水乙醇、95%乙醇等。

1.2 實驗動物

昆明種SPF級正常小鼠，2～3月齡，共20只，由右江民族醫學院實驗動物中心提供(SYXK桂20117-0004)。

1.3 儀器

電熱烤箱(上海慧泰儀器制造有限公司，型號：DHG-9070A)，顯微鏡(OLYMPUS，型號：CX21)，水浴箱(國營新醫療器械廠，型號：S648)。

2 方法

2.1 湯藥制備

茵陳蒿湯合五苓散加減方(茵陳蒿20 g、黨參20 g、梔子15 g、茯苓15 g、豬苓15 g、澤瀉15 g、白術15 g、大黃12 g、半枝蓮30 g、溪黃草30 g)加水1 500 mL，熬制45 min，最終湯藥約750 mL。4 ℃保存備用。

2.2 實驗分組及灌胃

對20只小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組各10只，正常喂食、喂水，每次灌胃前將灌胃針煮沸消毒10 min左右，中藥湯劑從4 ℃冰箱取出，37 ℃水浴加熱后，對實驗組灌胃給藥1 mL/只，4 h/次，2次/d，對照組不予處理。

2.3 取材方法

于灌胃第2天后，每天第2次灌胃4 h后，頸椎脫臼處死實驗組和對照組小鼠各1只，無菌取肝臟，甲醛固定。

2.4 免疫組化檢測

將所有小鼠取材后，制作石蠟切片，4 ℃下保存，脫蠟前置于電熱烤箱65 ℃下烘烤20 min，將每張石蠟切片脫蠟至水，PBS溶液洗滌5 min；將切片置于濕盒，滴加3%H2O2，于37 ℃恒溫水浴孵育10 min；用PBS洗滌2次，2 min/次，滴加BSA，37 ℃恒溫水浴封閉；30 min后棄多余BSA，分別滴加兔抗鼠anti-IL-6、anti-IL-18一抗，置于濕盒中，37 ℃水浴孵化2 h；移去一抗，PBS洗滌3次，2 min/次，滴加過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗，37 ℃濕盒孵育30 min，滴加顯色劑(DAB：A、B、C各25 μL，加純水1 000 μL)，鏡下觀察。

3 結果

3.1 茵陳蒿湯合五苓散加減方對小鼠體內細胞因子IL-6的影響

通過圖1可以看出，A圖為對照組小鼠肝組織IL-6免疫組化染色結果，從結果可以看出，在對照組正常小鼠中央靜脈和小葉間靜脈管壁都有陽性染色(棕紅色)；B圖為實驗組小鼠使用茵陳蒿湯合五苓散方灌胃第5天肝組織免疫組化的結果，中央靜脈管壁已無陽性染色，只有小葉間靜脈還有陽性染色；C圖實驗組小鼠使用茵陳蒿湯合五苓散方灌胃第6天肝組織免疫組化的結果，肝組織未發現陽性染色部位。

圖1 茵陳蒿湯合五苓散加減方對小鼠體內細胞因子IL-6的影響

3.2 茵陳蒿湯合五苓散加減方對小鼠體內細胞因子IL-18的影響

通過圖2可以看出，A圖為對照組小鼠肝組織IL-18免疫組化染色結果，對照組正常小鼠肝組織內部大部分區域都有細胞呈陽性染色(棕紅色)；B圖為實驗組小鼠使用茵陳蒿湯合五苓散方灌胃第5天肝組織免疫組化染色的結果，肝組織內部大部分區域已無細胞呈陽性染色，只有肝臟邊緣還有部分細胞呈陽性染色；C圖為實驗組小鼠使用茵陳蒿湯合五苓散方灌胃第6天肝組織免疫組化染色的結果，肝組織未發現陽性染色部位。

圖2 茵陳蒿湯合五苓散加減方對小鼠體內細胞因子IL-18的影響

4 討論

研究表明，炎癥與腫瘤的發生發展有密切關系，炎癥的遷延不愈可導致腫瘤的發生。IL-6、IL-18是機體內重要的炎癥因子，IL-6或IL-8等炎性細胞因子的激活，可促進肝臟間質細胞纖維化改變。IL-6主要與炎癥的發生以及腫瘤的發生轉移相關，正常情況下機體內IL-6也有表達[3]，但含量較低，當發生炎癥時IL-6會被巨噬細胞、B細胞以及T細胞大量分泌[4]，IL-6可通過STAT3信號傳導通路參與炎癥反應的發生，活化的STAT3又可上調TGF-1和下調其他致炎因子，這些炎癥因子又與抑制抗腫瘤免疫有關。此外，IL-6的持續性增高會加速肝細胞的損傷，迫使肝細胞發生“破壞-修復-破壞”的循環，在一定程度上參與了腫瘤的發生[5-9]。FUKE H等[10]對肝癌患者標本進行檢測發現STAT3的過度激活是IL-6/gp130高表達的結果，可見IL-6在肝癌的發生過程中可能存在重要作用。本實驗研究表明，對照組小鼠肝組織IL-6免疫組化染色顯示小血管管壁明顯強陽性染色，而實驗組經茵陳蒿湯合五苓散加減方灌胃后，IL-6的表達隨著灌胃次數的增加有逐漸減少的趨勢，于灌胃第5天，肝組織小血管管壁中IL-6的表達明顯下降，于灌胃第6天，肝組織中IL-6檢測呈陰性，可見茵陳蒿湯合五苓散加減方能調節IL-6的表達，茵陳蒿湯合五苓散加減方可能通過下調IL-6的表達，進而改變信號通路，達到護肝、抗腫瘤的功效。

IL-18也是一種炎癥刺激因子[11]，直接參與肝損傷，其參與肝損傷的機制可通過PAMPs通路，激活NLRP3炎癥小體，促使Caspase-1成熟，活化的Caspase-1可以使IL-18激活并使之聚集，大量的IL-18浸潤導致細胞損傷[12]。潮蓉[13]在研究酒精性肝損傷機制中發現，酒精性肝損傷小鼠IL-18表達明顯增強，說明IL-18也是肝損傷發生過程中的重要分子。本實驗研究發現，對照組小鼠肝組織中大部分區域都有細胞IL-18呈陽性染色，經茵陳蒿湯合五苓散加減方灌胃第5天發現IL-18陽性染色區域明顯減少，灌胃第6天，肝組織IL-18未發現陽性染色，表明茵陳蒿湯合五苓散加減方可調節IL-18的表達，有可能使用茵陳蒿湯合五苓散通過調節細胞因子，進而達到護肝、防治肝損傷乃至預防和治療肝癌的目的。