肉堿/有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體對元胡止痛方中主要藥性成分的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究

石 琳，王 澤，崔 濤，慈小燕，閆鳳英，伊秀林, *，武衛(wèi)黨2, *

肉堿/有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體對元胡止痛方中主要藥性成分的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究

石 琳1，王 澤2, 3，崔 濤4, 5，慈小燕4, 5，閆鳳英4, 5，伊秀林1, 4, 5*，武衛(wèi)黨2, 4, 5*

1. 安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230032 2. 天津藥物研究院 釋藥技術(shù)與藥代動(dòng)力學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300450 3. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193 4. 天津藥物研究院 生物技術(shù)中心，天津 300450 5. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥物代謝新技術(shù)創(chuàng)新單元，北京 100050

研究肉堿/有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（carnitine/organic cation transporter）N1、N2（OCTN1、OCTN2）對元胡止痛方中主要藥性成分的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，預(yù)測OCTN1和OCTN2在各藥性成分跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的作用。應(yīng)用OCTN1、OCTN2高表達(dá)細(xì)胞株S2-OCTN1、S2-OCTN2，測定元胡止痛方中主要苦味藥性成分延胡索乙素、巴馬汀、原阿片堿和辛味藥性成分歐前胡素、異歐前胡素對OCTN1、OCTN2的抑制作用及半數(shù)抑制濃度（IC50）。通過測定OCTN1、OCTN2及空白載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞Mock對不同藥性成分的攝取能力，判斷各藥性成分是否為OCTN1和OCTN2的底物，進(jìn)一步測定延胡索乙素在OCTN1和OCTN2中的米氏常數(shù)（m）和細(xì)胞攝取底物最大轉(zhuǎn)運(yùn)速率（max）。苦味藥性成分延胡索乙素、巴馬汀、原阿片堿和辛味藥性成分歐前胡素、異歐前胡素對OCTN1和OCTN2的轉(zhuǎn)運(yùn)活性有顯著抑制作用，對OCTN1的IC50分別是15.43、14.06、21.23、4.91、23.29 μmol/L；對OCTN2的IC50分別是19.08、14.24、8.90、17.06、13.98 μmol/L。OCTN1對延胡索乙素、巴馬汀和原阿片堿的攝取活性分別是Mock的3.46、8.72和2.88倍，OCTN2對延胡索乙素、巴馬汀和原阿片堿的攝取活性分別是Mock的2.58、5.86和9.75倍，OCTN1和OCTN2對歐前胡素和異歐前胡素的攝取活性與Mock均無顯著差異。轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，延胡索乙素在OCTN1上的m和max為6.39 μmol/L、120.92 pmol/(mg·min)，在OCTN2上的m和max為25.66 μmol/L、637.03 pmol/(mg·min)。元胡止痛方中的藥性成分延胡索乙素、巴馬汀、原阿片堿、歐前胡素和異歐前胡素對OCTN1和OCTN2的轉(zhuǎn)運(yùn)活性具有較強(qiáng)的抑制作用，其中延胡索乙素、巴馬汀和原阿片堿是OCTN1和OCTN2的底物，因此在不同藥性成分跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程中存在由OCTN1和OCTN2介導(dǎo)的藥物-藥物相互作用。

元胡止痛方；肉堿/有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體N1；肉堿/有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體N2；藥物-藥物相互作用；藥物轉(zhuǎn)運(yùn)；延胡索乙素；巴馬汀；原阿片堿；歐前胡素；異歐前胡素

五味藥性理論是中藥藥性理論的核心組成部分，主要包括酸、苦、甘、辛和咸5類不同的藥味，五味不僅反映中藥自身的功效屬性，更在臨床配伍應(yīng)用中得到了充分的體現(xiàn)，用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段和方法可對五味相應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行辨識和化學(xué)生物學(xué)表征研究，根據(jù)辨識和表征結(jié)果確定不同藥性成分的物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。利用現(xiàn)代科學(xué)理論和先進(jìn)技術(shù)手段對經(jīng)典名方中的關(guān)鍵化學(xué)成分進(jìn)行分析和確定，并結(jié)合現(xiàn)代藥效學(xué)、藥理學(xué)及生物信息學(xué)研究方法，闡明經(jīng)典名方的體內(nèi)過程、作用機(jī)制、配伍機(jī)制，不僅是實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的重要研究方向，也對更大程度地發(fā)揮經(jīng)典名方的臨床價(jià)值、指導(dǎo)臨床安全用藥具有重要意義[2]。

元胡止痛方由延胡索、白芷2味中藥組成，具有理氣、活血、止痛之功效，用于氣滯血瘀的胃痛、脅痛、頭痛及痛經(jīng)等的治療[3]。延胡索為罌粟科植物延胡索W. T. Wang的干燥塊莖，味苦、辛，性溫，歸肝、脾經(jīng)，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和催眠作用，對冠心病、心律失常、胃潰瘍等多種疾病有較好的臨床效果；主要藥效組分為延胡索乙素、巴馬汀、原阿片堿等生物堿類成分[4-5]。白芷為傘形科當(dāng)歸屬植物白芷(Fisch.ex Hoffm.) Benth. et Hook. f. 或杭白芷(Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f. var.(Boiss.) Shan et Yuan的干燥根，味辛，性溫，歸肺、胃經(jīng)，具有祛風(fēng)散寒、通竅止痛的功效；主要藥效組分為歐前胡素和異歐前胡素等香豆素類成分[6-7]。張鐵軍等[6]通過對元胡止痛滴丸的“性-效-物”三元關(guān)系和作用機(jī)制研究，將延胡索甲素、延胡索乙素、原阿片堿、歐前胡素和異歐前胡素等確定為元胡止痛方中主要藥效成分，并將其定義為“質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）”。研究人員還通過電子鼻和藥理學(xué)研究明確了延胡索乙素、巴馬汀、原阿片堿為延胡索中的苦味成分，歐前胡素和異歐前胡素為辛味成分[8-9]。

藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體是藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的載體，可通過影響中藥及其有效成分的吸收、分布、代謝和排泄等動(dòng)力學(xué)過程，進(jìn)而影響臨床療效和安全性。中藥復(fù)方中化學(xué)成分復(fù)雜，由藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)藥物-藥物相互作用對復(fù)方中各成分的體內(nèi)過程具有重要影響[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)中藥及其有效成分在體內(nèi)對藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能和表達(dá)起到調(diào)節(jié)作用，通過對藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的誘導(dǎo)或抑制作用，從而影響這些轉(zhuǎn)運(yùn)體底物在體內(nèi)的處置過程[12]。前期研究發(fā)現(xiàn)，元胡止痛方中各種藥性成分與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體之間存在廣泛的相互作用，一些重要的轉(zhuǎn)運(yùn)體對各藥性成分的歸經(jīng)以及配伍有重要影響[2,13]。為進(jìn)一步闡明藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體在元胡止痛方中不同藥性成分跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程及配伍中的作用，本研究選擇了有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體家族（organic cation transporters，OCT）中的2個(gè)重要成員OCTN1和OCTN2，研究藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體對各藥性成分的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。OCTN1和OCTN2為雙向轉(zhuǎn)運(yùn)體，在體內(nèi)分布較廣泛，在腎小管和肝臟中有較高表達(dá)，可介導(dǎo)內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)的分泌和重吸收[14]。本實(shí)驗(yàn)通過OCTN1和OCTN2對元胡止痛方不同藥性成分跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性的研究，明確OCTN1和OCTN2與不同藥性成分的關(guān)系，為闡明元胡止痛方不同藥性成分的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)過程，以及由藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體OCTN1和OCTN2引起的藥物相互作用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體高表達(dá)單克隆細(xì)胞株（S2-OCTN1、S2-OCTN2）、空白載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞S2-Mock，均由天津藥物研究院有限公司生物技術(shù)中心提供。

1.2 藥物與試劑

DMEM（批號8120029）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號1966174C），Gibco公司；100×青鏈霉素混合液（批號20200429），Solarbio公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號WXBD2695V），VETEC公司；延胡索乙素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號J140303），上海將來試劑有限公司；巴馬汀（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號110732-200506），中國食品藥品檢定研究院；原阿片堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.46%，批號MUST-15032410）、歐前胡素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號MUST-15030910）、異歐前胡素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號MUST-15040214），成都曼思特生物科技有限公司；14C-溴化四乙胺（14C- tetraethylammonium bromide，14C-TEA，批號130311）、14C-鹽酸左旋肉堿（14C-carnitine hydrochloride，14C-Car，批號685178），ARC公司；奎尼丁（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號10138583），Sigma公司；Watsons屈臣氏蒸餾水，屈臣氏公司；細(xì)胞孵育液（uptake buffer，UpB，含NaCl 125 mmol/L、KCl 4.8 mmol/L、葡萄糖5.6 mmol/L、KH2PO41.2 mmol/L、CaCl21.2 mmol/L、MgSO41.2 mmol/L、HEPEs 25 mmol/L，KOH調(diào)至pH 7.4）[15]由實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 主要儀器

BS124S分析天平，瑞士Sartorius公司；HERAcell 150i二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific公司；Tri-Carb 2910 TR放射性液體閃爍儀，美國PerKin Elmer公司；TMK-2K水浴鍋，日本亞速旺株式會社；Acquity H-Class超高效液相色譜儀、Xevo TQD三重四級桿質(zhì)譜儀，美國Waters公司；ZORBAX Eclipse XDB-C18反相色譜柱，Agilent公司；單人超凈生物安全柜，青島海爾生物醫(yī)療控股有限公司；ZHWY-上海智誠恒溫振蕩器，北京華威興業(yè)科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)板，Corning Costar公司。

2 方法

2.1 藥性成分液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸的乙腈溶液（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫：0～1 min，10% A；1～4 min，10%～35% A；4～7 min，35%～80% A；7～8 min，80% A。體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；柱溫35 ℃。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子化源，以多反應(yīng)監(jiān)測模式方式掃描，正離子模式檢測，用于定量分析的離子對分別為/356.50→192.20（延胡索乙素）、/352.2→336.1（巴馬汀）、/354.2→188.1（原阿片堿）、/271.1→202.9（歐前胡素）、/271.1→203.0（異歐前胡素）和/256.2→167.10（內(nèi)標(biāo)苯海拉明）。毛細(xì)管電壓3000 V，錐孔電壓30 V，去溶劑化溫度350 ℃，源溫度150 ℃。

2.1.3 對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取延胡索乙素、巴馬汀、原阿片堿、歐前胡素、異歐前胡素對照品及內(nèi)標(biāo)苯海拉明適量，分別用甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，制備延胡索乙素、巴馬汀、原阿片堿、歐前胡素、異歐前胡素和苯海拉明質(zhì)量濃度為100 μg/mL的儲備液和苯海拉明內(nèi)標(biāo)儲備液。

2.1.4 供試品溶液的制備 取50 μL細(xì)胞樣品上清液，加入150 μL內(nèi)標(biāo)甲醇溶液（10 ng/mL）渦旋混勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液為供試品溶液。

2.1.5 方法學(xué)考察

（1）線性關(guān)系考察：精密吸取延胡索乙素、巴馬汀、原阿片堿、歐前胡素、異歐前胡素和苯海拉明儲備液適量，用甲醇梯度稀釋成含有各藥性成分的混合對照品溶液和10 ng/mL的苯海拉明內(nèi)標(biāo)工作液，其中巴馬汀和原阿片堿的終質(zhì)量濃度為5、10、50、200、1000、4000、5000 ng/mL，延胡索乙素、歐前胡素和異歐前胡素終質(zhì)量濃度為10、20、100、400、2000、8000、10 000 ng/mL。取適量混合對照品溶液，按照“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)下條件，測定對延胡索乙素、巴馬汀、原阿片堿、歐前胡素、異歐前胡素和內(nèi)標(biāo)的峰面積。以待測成分與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（），待測成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 元胡止痛方中主要藥性成分的回歸方程

（2）準(zhǔn)確度和精密度：精密吸取延胡索乙素、巴馬汀、原阿片堿、歐前胡素、異歐前胡素和苯海拉明儲備液適量，用甲醇梯度稀釋成含有各藥性成分的質(zhì)控樣品溶液。取低、中、高質(zhì)量濃度（巴馬汀和原阿片堿為12.5、150、3750 ng/mL，延胡索乙素、歐前胡素和異歐前胡素為25、300、7500 ng/mL）的質(zhì)控樣品，連續(xù)進(jìn)樣6次，連做3批。結(jié)果顯示，延胡索乙素、巴馬汀、原阿片堿、歐前胡素和異歐前胡素準(zhǔn)確度在?3.52%～6.17%，批間精密度RSD為2.16%～8.57%，批內(nèi)精密度RSD為0.12%～5.63%。結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度、精密度良好，符合生物制品分析方法驗(yàn)證要求。

（3）回收率試驗(yàn)：取低、中、高質(zhì)量濃度（巴馬汀和原阿片堿為12.5、150、3750 ng/mL，延胡索乙素、歐前胡素和異歐前胡素為25、300、7500 ng/mL）的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度平行6份，進(jìn)樣測定峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得各藥性成分的質(zhì)量濃度，計(jì)算回收率。回收試驗(yàn)結(jié)果表明，各藥性成分在低、中、高3個(gè)濃度水平上回收率在98.24%～100.87%，RSD為1.36%～5.37%，回收率良好。

（4）穩(wěn)定性考察：將處理好的同一批樣品溶液，分別經(jīng)長期凍存（?20 ℃，30 d）、反復(fù)凍融3次和室溫放置12 h測定各藥性成分的峰面積，不同條件下各成分峰面積的RSD均小于12%，結(jié)果表明樣品溶液中各成分穩(wěn)定性良好。

2.2 不同藥性成分對OCTN1和OCTN2轉(zhuǎn)運(yùn)活性的影響

S2-OCTN1、S2-OCTN2及S2-Mock細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)，處于對數(shù)生長期時(shí)用胰酶消化使其分散為單細(xì)胞懸液，用培養(yǎng)基稀釋至2×105個(gè)/ mL，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板1 mL/孔，33 ℃、5% CO2培養(yǎng)2～3 d至細(xì)胞長滿各孔。將細(xì)胞置于37 ℃水浴槽中，棄去培養(yǎng)基，用37 ℃的UpB清洗細(xì)胞2次，加入1 mL UpB，37 ℃溫浴10 min。吸棄UpB，給藥組加入以UpB為溶劑配制的含放射性標(biāo)記的探針底物14C-TEA（OCTN1）、14C-Car（OCTN2）和100 μmol/L各藥性成分（延胡索乙素、巴馬汀、原阿片堿、歐前胡素和異歐前胡素）預(yù)熱的5 μmol/L混合溶液500 μL。以100 μmol/L奎尼丁為陽性對照，與探針底物同時(shí)加入。對照組為S2-Mock細(xì)胞，模型組和給藥組為S2-OCTN1和S2-OCTN2細(xì)胞，對照組、模型組只添加含放射性標(biāo)記的探針底物。各組設(shè)置3復(fù)孔。給藥時(shí)間S2-OCTN1和S2-OCTN2細(xì)胞分別為3 min和5 min，相應(yīng)的對照組S2-Mock細(xì)胞給藥時(shí)間分別為3 min和5 min。吸棄工作液，加入1 mL冰浴的UpB洗滌細(xì)胞2遍，終止反應(yīng)。然后每孔添加400 μL 0.1 mol/L NaOH裂解細(xì)胞；取細(xì)胞裂解液于上樣瓶中，添加3 mL的閃爍液，并用Tri-Carb 2910 TR放射性液體閃爍儀測定樣品中的放射性強(qiáng)度。

在不同藥性成分對OCTN1和OCTN2的轉(zhuǎn)運(yùn)活性半數(shù)抑制濃度（IC50）測定中，分別添加不同濃度（0、1、3、10、30和100 μmol/L）各藥性成分，每個(gè)濃度設(shè)置3復(fù)孔。

2.3 S2-OCTN1和S2-OCTN2細(xì)胞對不同藥性成分的攝取

細(xì)胞培養(yǎng)、接種方法和給藥時(shí)間同“2.2”項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)S2-Mock組、S2-OCTN1組、S2-OCTN2組，分別加入500 μL預(yù)熱含10 μmol/L各藥性成分或10 μmol/L各藥性成分＋100 μmol/L奎尼丁的UpB溶液。每組設(shè)置3復(fù)孔。吸棄工作液，加入1 mL冰浴的UpB洗滌細(xì)胞2遍，終止反應(yīng)。用細(xì)胞刮下細(xì)胞，每孔添加200 μL甲醇，超聲10 min，提取細(xì)胞中攝取的化合物；4 ℃、10 000 r/min離心5 min，取上清50 μL通過“2.1”項(xiàng)方法測定樣品中各藥性成分的含量。以BCA法測定的蛋白濃度加以校正。

2.4 延胡素乙素在S2-OCTN1和S2-OCTN2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)

《中國藥典》2020年版[16]規(guī)定元胡止痛方中指標(biāo)性成分為延胡索乙素，因此進(jìn)一步研究OCTN1和OCTN2對延胡索乙素轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)的影響。細(xì)胞培養(yǎng)、接種方法和給藥時(shí)間同“2.2”項(xiàng)。給予含不同濃度（0.3、1、3、10、30、100 μmol/L）延胡索乙素的UpB溶液500 μL，樣品處理同“2.3”項(xiàng)。采用“2.1”項(xiàng)方法測定樣品中延胡索乙素的含量。

2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

將僅含放射性標(biāo)記的探針底物14C-TEA和14C-Car的S2-OCTN1和S2-OCTN2細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)值設(shè)為C（單位為DPM），扣除本底組即S2-Mock細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)值（0），將C0定義為100%。以此為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算，對照組、模型組、給藥組的轉(zhuǎn)運(yùn)值設(shè)為，相對轉(zhuǎn)運(yùn)活性＝(0)/(C0)。每個(gè)數(shù)值代表一個(gè)實(shí)驗(yàn)組的平均值，用Microsoft Excel 2013軟件中統(tǒng)計(jì)學(xué)公式計(jì)算。通過GraphPad Prism 8.0軟件計(jì)算不同藥性成分對S2-OCTN1和S2-OCTN2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)活性的IC50。各數(shù)值間的差異性分析采用檢驗(yàn)。

攝取底物實(shí)驗(yàn)中將LC-MS/MS法測定的細(xì)胞裂解液中待測物濃度利用測得的蛋白濃度進(jìn)行校正。分別計(jì)算S2-OCTN1和S2-OCTN2細(xì)胞攝取量與S2-Mock攝取量的比值，當(dāng)比值大于2時(shí)，可認(rèn)為有主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生。攝取動(dòng)力學(xué)參數(shù)采用米氏方程進(jìn)行擬合計(jì)算。

max/(m/[])

為底物的轉(zhuǎn)運(yùn)速率，m為米氏常數(shù)，max為細(xì)胞攝取底物最大轉(zhuǎn)運(yùn)速率，為底物濃度

3 結(jié)果

3.1 不同藥性成分對OCTN1和OCTN2轉(zhuǎn)運(yùn)活性的抑制作用

元胡止痛方中不同藥性成分對OCTN1和OCTN2的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性有不同程度的抑制作用，見圖1。結(jié)果顯示苦味成分延胡索乙素、巴馬汀、原阿片堿和辛味成分歐前胡素、異歐前胡素對OCTN1的轉(zhuǎn)運(yùn)活性具有較強(qiáng)的抑制作用，分別能將OCTN1介導(dǎo)的14C-TEA跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性抑制至（48.59±2.17）%、（38.75±0.54）%、（43.35±0.87）%、（36.45±2.03）% 和（33.25±1.89）%。延胡索乙素、巴馬汀、原阿片堿、歐前胡素和異歐前胡素對OCTN2的轉(zhuǎn)運(yùn)活性具有較強(qiáng)的抑制作用，分別能將OCTN2介導(dǎo)的14C-Car跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性抑制至（39.13±2.87）%、（36.33±2.28）%、（35.25±1.46）%、（15.09±1.38）% 和（25.21±1.24）%。

苦味藥性成分延胡索乙素、巴馬汀、原阿片堿和辛味藥性成分歐前胡素、異歐前胡素對OCTN1轉(zhuǎn)運(yùn)活性抑制作用的IC50分別是15.43、14.06、21.23、4.91、23.29 μmol/L；延胡索乙素、巴馬汀、原阿片堿、歐前胡素和異歐前胡素對OCTN2轉(zhuǎn)運(yùn)活性抑制作用的IC50分別是19.08、14.24、8.90、17.06、13.98 μmol/L。結(jié)果表明延胡索乙素、巴馬汀、原阿片堿、歐前胡素和異歐前胡素對OCTN1和OCTN2的轉(zhuǎn)運(yùn)活性均有抑制作用。

與模型組比較：**P＜0.01

3.2 S2-OCTN1和S2-OCTN2細(xì)胞對不同藥性成分的攝取情況

S2-OCTN1和S2-OCTN2細(xì)胞對各藥性成分的攝取結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明OCTN1和OCTN2高表達(dá)細(xì)胞對苦味成分延胡索乙素、巴馬汀和原阿片堿的攝取能力與S2-Mock細(xì)胞有顯著差異（＜0.05、0.01），且能被OCTN1和OCTN2的抑制劑奎尼丁顯著抑制。延胡索乙素、巴馬汀和原阿片堿S2-OCTN1細(xì)胞攝取量分別是細(xì)胞S2-Mock的3.46、8.72和2.88倍，S2-OCTN2細(xì)胞攝取量分別是S2-Mock細(xì)胞的2.58、5.86和9.75倍。S2-OCTN1和S2-OCTN2細(xì)胞對歐前胡素和異歐前胡素的攝取量與S2-Mock細(xì)胞的比值均小于2。表明苦味成分延胡索乙素、巴馬汀、原阿片堿是OCTN1和OCTN2的底物，可在OCTN1和OCTN2的協(xié)助下完成跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

3.3 S2-OCTN1和S2-OCTN2細(xì)胞對延胡索乙素的轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)

S2-OCTN1和S2-OCTN2細(xì)胞對延胡索乙素轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)結(jié)果見圖3、4。結(jié)果顯示S2-OCTN1和S2-OCTN2細(xì)胞對延胡索乙素的攝取呈劑量相關(guān)性，符合米氏方程。OCTN1和OCTN2對延胡索乙素轉(zhuǎn)運(yùn)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)m和max分別為6.39 μmol/L、120.92 pmol/(mg·min)和25.66 μmol/L、637.03 pmol/(mg·min)。

4 討論

近年來關(guān)于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體引起的藥物-藥物相互作用的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)[17-20]，轉(zhuǎn)運(yùn)體不僅能夠影響藥物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過程，更是與藥物發(fā)生相互作用和疾病相關(guān)聯(lián)，使其成為重要的藥物靶點(diǎn)，這對新藥的研發(fā)、提高藥物生物利用度和疾病的治療作用提供了新的思路和理論依據(jù)。中藥復(fù)方化學(xué)成分復(fù)雜，各藥性成分在體內(nèi)傳遞過程中發(fā)生藥物-藥物相互作用的概率也相對較高，因此以藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的藥物-藥物相互作用為切入點(diǎn)，通過研究藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體在各藥性成分跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的作用機(jī)制，進(jìn)而從藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的角度推測各藥對在宏觀層面的作用規(guī)律，對闡明中藥復(fù)方中不同藥性成分的配伍機(jī)制具有重要意義[2]。

與S2-Mock組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與S2-OCTN1的藥性成分+奎尼丁組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與S2-OCTN2的藥性成分+奎尼丁組比較：▲P＜0.05 ▲▲P＜0.01

圖3 OCTN1對延胡索乙素的轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)()

圖4 OCTN2對延胡索乙素的轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)()

OCTN1和OCTN2廣泛存在于腎臟、肝臟、心臟、骨骼肌、大腦、胎盤、小腸和骨骼肌等組織中[21]，尤其在腎臟和肝臟中表達(dá)量較高，因此是一些主要在腎臟和肝臟進(jìn)行消除的藥物進(jìn)入腎臟和肝臟的重要途徑。本研究結(jié)果顯示，元胡止痛方中苦味成分延胡索乙素、巴馬汀、原阿片堿和辛味成分歐前胡素、異歐前胡素對OCTN1和OCTN2具有較強(qiáng)的抑制作用，延胡索乙素、巴馬汀、原阿片堿是OCTN1和OCTN2的底物，因此預(yù)測元胡止痛方不同藥性成分之間很可能會發(fā)生由OCTN1和OCTN2介導(dǎo)的藥物-藥物相互作用。歐前胡素和異歐前胡素通過抑制OCTN1、OCTN2影響延胡索乙素、巴馬汀、原阿片堿跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，減少苦味藥成分延胡索乙素、巴馬汀、原阿片堿在腎臟和肝臟的攝入，從而減慢其在腎臟和肝臟的消除過程，進(jìn)而使延胡索乙素、巴馬汀、原阿片堿等成分血藥濃度的增加，苦味藥性成分血藥濃度的升高有利于更多的苦味藥性成分跨過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，增強(qiáng)其鎮(zhèn)痛作用。本研究結(jié)果表明，元胡止痛方中不同藥性成分之間在體內(nèi)傳遞過程中存在較為復(fù)雜的相互作用，并且在一定程度上可以從藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的角度進(jìn)行闡釋，這對闡明元胡止痛方中延胡索和白芷配伍機(jī)制的科學(xué)內(nèi)涵具有重要的啟發(fā)意義。但中藥及中藥復(fù)方藥理活性成分復(fù)雜，可能一種活性成分同時(shí)作用于多種轉(zhuǎn)運(yùn)體，而不同轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的底物又存在一定的交叉重疊，因此藥物-藥物相互作用機(jī)制還需做進(jìn)一步探索和挖掘。另外，本研究從藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體引起的藥物-藥物相互作用的角度揭示元胡止痛方中各藥性成分的配伍機(jī)制，也為闡明其他中藥復(fù)方的配伍機(jī)制提供了一定的參考，同時(shí)也豐富了中藥配伍理論研究的思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 張鐵軍, 劉昌孝. 中藥五味藥性理論辨識及其化學(xué)生物學(xué)實(shí)質(zhì)表征路徑 [J]. 中草藥, 2015, 46(1): 1-6.

[2] Wang Z, Shang H H, Li Y Z,. Transporters (OATs and OATPs) contribute to illustrate the mechanism of medicinal compatibility of ingredients with different properties in yuanhuzhitong prescription [J]., 2020, 10(9): 1646-1657.

[3] Chen Y T, Cao Y, Xie Y H,. Traditional Chinese medicine for the treatment of primary dysmenorrhea: How do Yuanhu painkillers effectively treat dysmenorrhea? [J]., 2013, 20(12): 1095-1104.

[4] 賀凱, 高建莉, 趙光樹. 延胡索化學(xué)成分、藥理作用及質(zhì)量控制研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2007, 38(12): 1909-1912.

[5] 高攀, 王津燕, 吳環(huán)宇, 等. HPLC-CAD法測定元胡止痛膠囊中生物堿和香豆素[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2019, 34(2): 299-303.

[6] 張鐵軍, 許浚, 申秀萍, 等. 基于中藥質(zhì)量標(biāo)志物(Q-Marker)的元胡止痛滴丸的“性-效-物”三元關(guān)系和作用機(jī)制研究 [J]. 中草藥, 2016, 47(13): 2199-2211.

[7] 韓彥琪, 許浚, 龔蘇曉, 等. 基于味覺、嗅覺受體分子對接技術(shù)的中藥性味物質(zhì)基礎(chǔ)研究的路徑和方法 [J]. 中草藥, 2018, 49(1): 14-19.

[8] 韓彥琪, 許浚, 龔蘇曉, 等. 基于HPLC-QTOF/MS及G蛋白偶聯(lián)受體分析的延胡索物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 51(8): 1302-1308.

[9] 孫玉平. 頭痛滴丸處方藥材藥味分析和提取工藝研究[D]. 天津: 天津中醫(yī)藥大學(xué), 2015.

[10] 董仁超, 孟強(qiáng). 轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的中藥和藥物間相互作用 [J]. 世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2019, 21(2): 215-219.

[11] 韓向暉, 馬越鳴. 中藥調(diào)控藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體活性及表達(dá)研究進(jìn)展 [J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志, 2013, 20(1): 103-106.

[12] 楊世磊, 劉克辛. 藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的中藥及單體藥物相互作用的研究進(jìn)展 [J]. 藥物評價(jià)研究, 2019, 42(1): 194-203.

[13] 王澤, 武衛(wèi)黨, 慈小燕, 等. 有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1和3在不同藥性中藥成分跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用 [J]. 中國臨床藥理學(xué)雜志, 2019, 35(4): 372-376.

[14] 陳佳音, 盧楊, 趙娣, 等. 肉堿/有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(OCTNs) 的研究進(jìn)展 [J]. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2016, 21(10): 1185-1190.

[15] Nakamura T, Yoshida K, Yabuuchi H,. Functional characterization of ergothioneine transport by rat organic cation/carnitine transporter Octn1 (slc22a4) [J]., 2008, 31(8): 1580-1584.

[16] 中國藥典 [S]. 一部. 2020: 630-633.

[17] 武衛(wèi)黨, 崔濤, 張星艷, 等. 小檗堿對有機(jī)陽離子藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制作用研究 [J]. 藥物評價(jià)研究, 2017, 40(5): 633-637.

[18] 武衛(wèi)黨, 張星艷, 魏滋鴻, 等. 小檗堿對有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制作用及雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)研究 [J]. 藥物評價(jià)研究, 2017, 40(6): 778-782.

[19] Yin J, Wagner D J, Prasad B,. Renal secretion of hydrochlorothiazide involves organic anion transporter 1/3, organic cation transporter 2, and multidrug and toxin extrusion protein 2-K [J]., 2019, 317(4): F805-F814.

[20] Koepsell H. Organic cation transporters in health and disease [J]., 2020, 72(1): 253-319.

[21] Tamai I. Pharmacological and pathophysiological roles of carnitine/organic cation transporters (OCTNs: SLC22A4, SLC22A5 and Slc22a21) [J]., 2013, 34(1): 29-44.

Mechanism of transmembrane transport of main medicinal components in Yuanhu Zhitong Prescription by OCTNs

SHI Lin1, WANG Ze2, 3, CUI Tao4, 5, CI Xiao-yan4, 5, YAN Feng-ying4, 5, YI Xiu-lin1, 4, 5, WU Wei-dang2, 4, 5

1. School of Pharmacy, Anhui Medical University, Hefei 230032, China 2. State Key Laboratory of Drug Delivery Technology and Pharmacokinetics, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300450, China 3. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China 4. Biotechnology Center, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300450, China 5. Research Unit for Drug Metabolism, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China

To study the transmembrane transport mechanism of carnitine / organic cation transporters 1 and 2 (OCTN1 and OCTN2) on the main medicinal components of Yuanhu Zhitong Prescription (元胡止痛方), and predict the role of OCTN1 and OCTN2 in the transmembrane transport of various medicinal components.The OCTN1, OCTN2 highly expressed cell lines S2-OCTN1, S2-OCTN2 were used to detect the inhibitory effects and half inhibitory concentrations (IC50) of main bitter medicinal components tetrahydropalmatine, palmatine, protopine and pungent medicinal components imperatorin and isoimperatorin on OCTN1 and OCTN2 in Yuanhu Zhitong Prescription. By measuring the uptake ability of OCTN1, OCTN2 and blank vector transfected cell Mock to different drug components, it was judged whether the drug components were the substrate of OCTN1 and OCTN2. The michaelis constant (m)and the maximum transport rate (max) of the substrate uptake by the cell of tetrahydropalmatine in OCTN1 and OCTN2 were further determined.Bitter medicinal components tetrahydropalmatine, palmatine, and protopine and pungent medicinal components imperatorin and isoimperatorin significantly inhibited the transport activity of OCTN1 and OCTN2, the IC50of inhibitory effect of which on OCTN1 was 15.43, 14.06, 21.23, 4.91, and 23.29 μmol/L, respectively; And the IC50of inhibitory effect on OCTN2 was 19.08, 14.24, 8.90, 17.06, and 13.98 μmol/L, respectively. The uptake activity of OCTN1 to tetrahydropalmatine, palmatine and protopine was 3.46, 8.72, and 2.88 times higher than that of Mock, and the uptake activity of OCTN2 to tetrahydropalmatine, palmatine and protopine was 2.58, 5.86, and 9.75 times higher than that of Mock, respectively. The uptake activity of OCTN1 and OCTN2 on imperatorin and isoimperatorin was not significantly different from Mock. Themandmaxof tetrahydropalmatine on OCTN1 were 6.39 μmol/L and 120.92 pmol/mg protein/min, on OCTN1 were 25.66 μmol/L and 637.03 pmol/mg protein/min.Tetrahydropalmatine, palmatine, protopine, imperatorin, and isoimperatorin in Yuanhu Zhitong Prescription have strong inhibitory effects on the transport activity of OCTN1 and OCTN2, in which tetrahydropalmatine, palmatine and protopine are the substrates of OCTN1 and OCTN2, so there is drug-drug interaction mediated by OCTN1 and OCTN2 in the process of transmembrane transport of different medicinal components.

Yuanhu Zhitong Prescription; OCTN1; OCTN2; drug-drug interaction; drug transport; tetrahydropalmatine; palmatine; protopine; imperatorin; isoimperatorin

R285

A

0253 - 2670(2021)08 - 2384 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.08.022

2020-12-17

釋藥技術(shù)與藥代動(dòng)力學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津藥物研究院）自主研究課題資助（010161002）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（2019-I2M-5-020）；藥物一致性評價(jià)關(guān)鍵技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)研究項(xiàng)目（2017zx09101001-004）

石 琳（1995—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗巹?dòng)學(xué)。Tel: (022)84478813 E-mail: shilin9503@163.com

伊秀林，研究員，碩士生導(dǎo)師。Tel: (022)84478812 E-mail: yixl@tjipr.com

武衛(wèi)黨，副研究員，博士。Tel: (022)84478813 E-mail: wuwd@tjipr.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]