黃綿馬酸BB對革蘭陽性致病菌的抗菌活性和生物被膜清除作用研究

莫梓童，吳小詩，殷川平，唐春萍，沈志濱, 2, 3*

黃綿馬酸BB對革蘭陽性致病菌的抗菌活性和生物被膜清除作用研究

莫梓童1，吳小詩1，殷川平1，唐春萍1，沈志濱1, 2, 3*

1. 廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006 2. 廣東省局部精準藥物遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006 3. 廣東省化妝品工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006

探究黃綿馬酸BB對3種革蘭陽性致病菌的抗菌活性及生物被膜的清除作用。采用微量稀釋法測定黃綿馬酸BB對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant，MRSA）、糞腸球菌（，EFA）及屎腸球菌（，EFM）15株臨床分離株的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）；考察黃綿馬酸BB對MRSA2、EFA13和EFM15生長周期的影響；采用CCK-8法、掃描電子顯微鏡（SEM）考察黃綿馬酸BB對MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜的清除作用。黃綿馬酸BB對MRSA的MIC為11.49～63.50 μg/mL、MBC為22.98～160.00 μg/mL，對EFA的MIC為7.07～160.00 μg/mL、MBC為28.28～160.00 μg/mL，對EFM的MIC為16.82 μg/mL、MBC為56.57 μg/mL，其中黃綿馬酸BB對MRSA1、2和EFA14、15的MIC均小于莫匹羅星；黃綿馬酸BB對MRSA2、EFA13和EFM15的生長具有抑制作用，能延遲受試菌進入對數(shù)生長期；MIC黃綿馬酸BB對MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜的清除率分別達到85.15%、76.48%、82.31%，均優(yōu)于莫匹羅星、萬古霉素、達托霉素；黃綿馬酸BB對MRSA2生物被膜聚集及成熟階段的清除效果優(yōu)于達托霉素，對EFA13生物被膜聚集及成熟階段的清除效果優(yōu)于莫匹羅星、萬古霉素、達托霉素，對EFM15生物被膜成熟階段的清除效果優(yōu)于莫匹羅星、萬古霉素、達托霉素。黃綿馬酸BB具有良好的體外抑菌活性以及對生物被膜的清除作用。

革蘭陽性球菌；黃綿馬酸BB；抗菌藥物；抗菌活性；生物被膜

革蘭陽性球菌是臨床常見的致病菌，可引起多種感染，甚至形成敗血癥、多器官化膿性感染，危害人類的生命健康[1]。金黃色葡萄球菌、糞腸球菌，EFA）和屎腸球菌（，EFM）為革蘭陽性球菌中具代表性的致病菌，其對抗生素的耐藥性不斷增強[2]。革蘭陽性球菌形成的生物被膜是對抗生素耐藥性增強的最主要原因之一。生物被膜是由細菌自身產(chǎn)生、胞外聚合物包裹并黏附于機體表面的多細胞群體結(jié)構(gòu)，不僅具有多重耐藥性及免疫逃逸能力，還表現(xiàn)出高致病性、難治愈的特性[3]。近年來研究顯示，革蘭陽性球菌對常見的抗菌藥物如莫匹羅星產(chǎn)生了不同程度的耐藥性[4]，而被稱為“抗菌最后一道防線”的萬古霉素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantMRSA）的敏感性逐步下降[5]，萬古霉素中介耐藥的MRSA檢出率逐年攀升[6]。因此，從傳統(tǒng)中藥中尋找具有抗菌活性的化合物具有重要意義。

香鱗毛蕨(L.) Schott是鱗毛蕨科鱗毛蕨屬植物，主要分布在黑龍江省五大連池等地區(qū)[7]，民間常用香鱗毛蕨治療牛皮癬、頭癬等多種皮膚病。香鱗毛蕨中的間苯三酚類化合物因其獨特的抗菌活性受到人們的關(guān)注[8]，黃綿馬酸BB作為其中典型的間苯三酚類化合物，對MRSA表現(xiàn)出良好的抗菌活性[9]，但黃綿馬酸BB對革蘭陽性球菌生物被膜形成的作用暫無報道。本研究通過探究黃綿馬酸BB對革蘭陽性常見致病菌MRSA、EFA和EFM的抗菌活性和生物被膜的清除作用，為黃綿馬酸BB的抗感染新藥開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 菌株

10株MRSA臨床分離株（MRSA1～10）、4株糞腸球菌臨床分離株（EFA1～14）、1株屎腸球菌臨床分離株（EFM15）由廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司惠贈。

1.2 藥品與試劑

黃綿馬酸BB（質(zhì)量分數(shù)＞95%）由課題組自制；萬古霉素（質(zhì)量分數(shù)＞97%，批號N0827A）購自美國Sigma公司；達托霉素（質(zhì)量分數(shù)＞97%，批號M0726A）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；莫匹羅星（質(zhì)量分數(shù)＞97%，批號80200123218）購自中美天津史克制藥有限公司；CAMHB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號2017090）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號3105705）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB，批號1090952）購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 儀器

SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司）；iMark酶標儀（美國BIO-RAD公司）；Memmert恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）；XYQ-SG46-280S電熱手提式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司）；JEM-2100HR冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM，日本電子株式會社）。

2 方法

2.1 菌液制備

將上述菌株用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，根據(jù)美國臨床實驗室標準協(xié)會（clinical and laboratory standards institute，CLSI）制定的M07-A9方案中微量稀釋法，將處于對數(shù)生長期的菌落用CAMHB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基稀釋成1×106CFU/mL的接種菌液[10]。

2.2 藥液制備

黃綿馬酸BB、莫匹羅星、萬古霉素、達托霉素分別溶于二甲基亞砜，配制成質(zhì)量濃度為64 mg/mL的藥物儲備液。

2.3 黃綿馬酸BB對受試菌株的抗菌活性測定

采用微量稀釋法測定黃綿馬酸BB和陽性對照藥物（莫匹羅星、萬古霉素、達托霉素）對受試菌株的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。用CAMHB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基將藥物儲備液進行稀釋，取100 μL藥物儲備液加入96孔板中，再加入100 μL菌液，使黃綿馬酸BB、莫匹羅星、萬古霉素、達托霉素的終質(zhì)量濃度均為5.00～2 560.00 μg/mL，對照組只加入菌液不加入藥液。于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后，測定MIC。選擇質(zhì)量濃度≥MIC的菌懸液，吸取20 μL涂于固體培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后肉眼觀察，以無細菌生長的最低藥物濃度作為MBC。

2.4 黃綿馬酸BB對MRSA2、EFA13和EFM15生長曲線的測定

根據(jù)抗菌活性結(jié)果，選用對黃綿馬酸BB敏感的MRSA2、EFA13和EFM15作為受試菌，測定黃綿馬酸BB對其生長的影響。設置對照組及黃綿馬酸BB（1/2 MIC、MIC、2 MIC）組，各給藥組加入含相應藥物的菌液，對照組只加入菌液不加入藥液，于37 ℃振蕩培養(yǎng)，每2小時采用酶標儀測定24 h內(nèi)600 nm處的吸光度（）值。以時間為橫坐標，值為縱坐標，繪制時間-曲線。

2.5 黃綿馬酸BB對MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜的清除作用

2.5.1 MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜生長曲線的測定 用TSB培養(yǎng)基將菌懸液稀釋至1×106CFU/mL，取200 μL接種于96孔板中，于37 ℃分別培養(yǎng)0、3、6、9、12、24、36、48 h，棄去懸浮菌液，PBS漂洗3次，棄去上清液，每孔加入100 μL TSB培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑，37 ℃避光孵育2 h，采用酶標儀測定450 nm處值，繪制值-時間曲線。

2.5.2 黃綿馬酸BB對MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜不同生長階段清除率的影響 用TSB培養(yǎng)基將菌懸液稀釋至1×106CFU/mL，取200 μL接種于96孔板中，MRSA2于37 ℃分別培養(yǎng)3、9、36 h，EFA13和EFM15于37 ℃分別培養(yǎng)3、6、24 h，PBS漂洗3次，棄去上清液；分別加入200 μL含不同質(zhì)量濃度黃綿馬酸BB及各陽性對照藥的TSB培養(yǎng)基，使各藥物的終質(zhì)量濃度為5.00～2 560.00 μg/mL，對照組只加入菌液不加入藥液，陰性對照組只加入培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS漂洗3次，棄上清液，每孔加入100 μL TSB培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑，37 ℃避光孵育2 h，采用酶標儀測定450 nm處的值，計算藥物對受試菌生物被膜的清除率。

清除率＝(陰性對照-藥物)/(陰性對照–對照)

2.5.3 SEM觀察黃綿馬酸BB對MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜不同生長階段的清除效果 將14 mm無菌圓形爬片放入24孔板中，用TSB培養(yǎng)基將菌懸液稀釋至1×106CFU/mL，取1 mL接種于24孔板中，MRSA2于37 ℃分別培養(yǎng)3、9、36 h，EFA13和EFM15于37 ℃分別培養(yǎng)3、6、24 h，棄去懸浮液，PBS漂洗3次，棄去上清液。設置對照組及黃綿馬酸BB（1/2 MIC、MIC、2 MIC）組，各給藥組加入含相應藥物的TSB培養(yǎng)基，對照組只加TSB培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)24 h，無菌PBS沖洗3次，棄上清液，制備SEM標本，SEM下觀察并拍照[11]。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有實驗重復3次，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。

3 結(jié)果

3.1 黃綿馬酸BB對受試菌株的抗菌活性

如表1所示，黃綿馬酸BB對15株受試菌的MIC為7.07～160.00 μg/mL，MBC為22.98～160.00 μg/mL；萬古霉素對15株受試菌的MIC為0.50～1.00 μg/mL，MBC為0.50～4.00 μg/mL；達托霉素對15株受試菌的MIC為0.50～8.00 μg/mL，MBC為1.00～16.00 μg/mL；莫匹羅星對15株受試菌的MIC為0.25～2 560.00 μg/mL，MBC為1.00～5 120.00 μg/mL。黃綿馬酸BB抑菌活性由高到低排序依次為EFA13＞MRSA2＞EFM15＞其他受試菌株。黃綿馬酸BB對MRSA2、EFA13、EFM15抗菌活性較好，因此選取MRSA2、EFA13和EFM15作為黃綿馬酸BB時間-殺菌曲線和生物被膜清除率實驗的受試菌株。

3.2 黃綿馬酸BB對受試菌株生長曲線的影響

如圖1所示，對照組MRSA2接種4 h后進入對數(shù)生長期，1/2 MIC、MIC黃綿馬酸BB將對數(shù)生長期延遲至6 h，2 MIC黃綿馬酸BB將對數(shù)生長期延遲至8 h；對照組EFA13接種4 h后進入對數(shù)生長期，黃綿馬酸BB組菌株6 h后進入對數(shù)生長期；對照組EFM15接種6 h后進入對數(shù)生長期，MIC、2 MIC黃綿馬酸BB將對數(shù)生長期分別延遲至8、12 h。表明黃綿馬酸BB對MRSA2、EFA13和EFM15的生長具有良好的抑制作用，呈劑量相關(guān)性。

3.3 MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜的生長曲線

受試菌生物被膜的形成分為初黏附階段、聚集階段和生物膜成熟階段。如圖2所示，MRSA2、EFA13和EFM15均在培養(yǎng)3 h后達到初黏附階段；EFA13和EFM15在3～6 h為聚集階段，6～24 h形成成熟的生物被膜；MRSA2在3～9 h為聚集階段，9～36 h形成成熟生物被膜。

表1 黃綿馬酸BB對受試菌株的MIC和MBC

圖1 黃綿馬酸BB對MRSA2 (A)、EFA13 (B) 和EFM15 (C) 的時間-殺菌曲線

圖2 MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜的生長曲線

3.4 黃綿馬酸BB對MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜不同生長階段清除率的影響

如圖3-A～C所示，初黏附階段，黃綿馬酸BB對MRSA2生物被膜的清除率呈劑量相關(guān)性，萬古霉素對MRSA2生物被膜的清除率優(yōu)于黃綿馬酸BB；聚集階段，黃綿馬酸BB對MRSA2生物被膜的清除率均優(yōu)于各陽性對照藥物；成熟階段，黃綿馬酸BB對MRSA2生物被膜的清除率仍保持在較高的水平，其清除率優(yōu)于達托霉素。

如圖3-D～F所示，初黏附階段和聚集階段，黃綿馬酸BB對EFA13生物被膜的清除率處于較高水平，其清除率與萬古霉素、達托霉素相當，優(yōu)于莫匹羅星；成熟階段，黃綿馬酸BB對EFA13生物被膜的清除率均優(yōu)于各陽性對照藥物。

如圖3-G～I所示，初黏附階段，黃綿馬酸BB對EFM15生物被膜仍有明顯的清除作用，其清除率與萬古霉素、達托霉素相當，優(yōu)于莫匹羅星；聚集階段，黃綿馬酸BB對EFM15生物被膜的清除率均優(yōu)于各陽性對照藥物；成熟階段，黃綿馬酸BB對EFM15生物被膜的清除作用仍較為明顯，其效果優(yōu)于各陽性對照藥物。

綜上，黃綿馬酸BB對MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜不同生長階段均表現(xiàn)出較好的清除作用，其中EFA13對黃綿馬酸BB的清除作用最為敏感，MIC黃綿馬酸BB對生物被膜的清除作用均優(yōu)于莫匹羅星、萬古霉素、達托霉素。

A、D、G-初黏附階段（培養(yǎng)3 h） B、E、H-聚集階段（培養(yǎng)6 h） C、F、I-成熟階段（培養(yǎng)24 h）

3.5 黃綿馬酸BB對MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜不同生長階段的清除效果

如圖4～6所示，對照組MRSA2、EFA13和EFM15生物被膜細胞形態(tài)正常，菌體細胞間結(jié)合緊密，胞外基質(zhì)黏附于受試菌表面，結(jié)聚成團，呈片狀生物被膜，且隨培養(yǎng)時間的增加，生物被膜厚度增加。在生物膜形成的相同階段，1/2 MIC黃綿馬酸BB組各受試菌形態(tài)基本正常，分泌的胞外基質(zhì)較對照組少，部分生物被膜結(jié)構(gòu)稀疏；MIC黃綿馬酸BB組各受試菌形態(tài)基本正常，生物被膜結(jié)構(gòu)較1/2 MIC黃綿馬酸BB組更為稀疏，且生物被膜表面細菌排列混亂；2 MIC黃綿馬酸BB組各受試菌菌體變形、皺縮，生物被膜結(jié)構(gòu)瓦解，甚至無菌團，僅有零星的單個菌體。

4 討論

隨著廣譜抗生素的濫用，革蘭陽性球菌的耐藥性逐年升高。因此，尋找具有抗菌活性的化合物，取代或部分取代抗生素成為研究的熱點。香鱗毛蕨中間苯三酚類對多種真菌均具有較好的抑制作用，黃綿馬酸BB作為其中間苯三酚類的有效抗菌成分之一，目前有關(guān)其抗革蘭陽性球菌的報道較少。根據(jù)CLSI中M100-S22方案，當藥物對微生物的MBC/MIC≥32時，可判定該微生物對該受試藥產(chǎn)生了耐受性[12]。本研究結(jié)果顯示，MRSA1、2、6和EFA11～14對莫匹羅星均產(chǎn)生耐藥性，MRSA2、5、6、10以及EFA13、14對達托霉素的敏感性下降，黃綿馬酸BB對莫匹羅星耐藥以及達托霉素敏感性下降的MRSA、EFA臨床分離株均有良好的敏感性，具有開發(fā)成抗革蘭陽性球菌感染新藥的潛力。

圖4 黃綿馬酸BB對MRSA2各階段生物被膜的清除作用

圖5 黃綿馬酸BB對EFA13各階段生物被膜的清除作用

圖6 黃綿馬酸BB對EFM15各階段生物被膜的清除作用

臨床研究發(fā)現(xiàn)，MRSA、EFA和EFM均有較強的生物被膜形成能力，抗菌藥物難以達到有效殺菌濃度，從而對抗生素產(chǎn)生耐藥性[13]。本研究通過CCK-8法首次探究了黃綿馬酸BB對生物被膜的清除作用，發(fā)現(xiàn)黃綿馬酸BB對受試菌株形成的生物被膜均表現(xiàn)出較好的清除作用，尤其在生物被膜的聚集階段及成熟階段，其作用效果均優(yōu)于莫匹羅星和達托霉素。通過SEM觀察各受試菌株的生物被膜，發(fā)現(xiàn)1/2 MIC黃綿馬酸BB可以抑制生物被膜的形成，減少胞外基質(zhì)的生成，提示黃綿馬酸BB可干擾生物被膜的形成，有希望開發(fā)為治療生物被膜感染的藥物。MIC黃綿馬酸BB對MRSA2、EFA13和EFM15成熟的生物被膜的清除率分別為85.15%、76.48%、82.31%，其效果均優(yōu)于各陽性對照藥物。

綜上，本研究以革蘭陽性球菌中常見致病菌為研究對象，闡述了黃綿馬酸BB的抗菌活性以及對生物被膜的清除作用，為間苯三酚類化合物抗菌作用提供了理論依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Antibacterial activity and antibiofilm effect of flavaspidic acid BB against gram-positive pathogenic bacteria

MO Zi-tong1, WU Xiao-shi1, YIN Chuan-ping1, TANG Chun-ping1, SHEN Zhi-bin1, 2, 3

1. School of Traditional Chinese Medicines, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China 2. Guangdong Provincial Engineering Center of Topical Precise Drug Delivery System Preperations, Guangzhou 510006, China 3. Guangdong Provincial Cosmetics Engineering Technology Research Center, Guangzhou 510006, China

To explore the antibacterial activity of flavaspidic acid BB on three kinds of gram-positive pathogenic bacteria and the scavenging effect of biofilm.Microdilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of flavaspidic acid BB on 15 clinical isolates of methicillin-resistant(MRSA),(EFA) and(EFM); Effect of flavaspidic acid BB on growth cycle of MRSA2, EFA13 and EFM15 was investigated; CCK-8 method and scanning electron microscopy (SEM) were used to investigate the scavenging effect of flavaspidic acid BB on MRSA2, EFA13 and EFM15 biofilms.MIC and MBC of flavaspidic acid BB for MRSA were 11.49 — 63.50 μg/mL and 22.98 — 160.00 μg/mL; MIC and MBC for EFA were 7.07 — 160.00 μg/mL and 28.28 — 160.00 μg/mL; MIC and MBC for EFM were 16.82 μg/mL and 56.57 μg/mL. MIC of flavaspidic acid BB for MRSA1 — 2 and EFA14 — 15 were lower than that of mupirocin. Growth of MRSA2, EFA13 and EFM15 were inhibited by flavaspidic acid BB, which could delay the test bacteria entering the logarithmic growth phase. Clearance rates of MRSA2, EFA13 and EFM15 biofilms by flavaspidic acid BB (MIC) were respectively 85.15%, 76.48% and 82.31%, which were better than mupirocin, vancomycin and daptomycin. Clearing effect of flavaspidic acid BB on MRSA2 biofilm in accumulation and maturation stage were better than daptomycin, clearing effect of flavaspidic acid BB on EFA13 biofilm in accumulation and maturation stage were better than mupirocin, vancomycin and daptomycin, clearing effect of flavaspidic acid BB on EFM15 biofilm in maturation stage were better than mupirocin, vancomycin and daptomycin.Flavaspidic acid BB had a good antibacterial activityand clearing effect on biofilms.

gram-positive bacteria; flavaspidic acid BB; antibacterial agents; antibacterial activity; biofilm

R285.5

A

0253 - 2670(2021)08 - 2324 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.08.015

2021-01-08

國家重點研發(fā)計劃“中醫(yī)藥現(xiàn)代化”重點專項項目（2018YFC1707100）；廣東省科技廳應用型研發(fā)專項（2015B020234009）

莫梓童（1996—），女，碩士研究生，研究方向為中藥提取分離技術(shù)與應用。E-mail: 805681335@qq.com

沈志濱（1964—），女，教授，博士，研究方向為中藥藥效物質(zhì)基礎及新藥研發(fā)。E-mail: szb8113@126.com

[責任編輯 李亞楠]