基于HPLC-Q-TOF-MS/MS技術的七味通痹口服液化學成分分析

唐 明，高 霞，耿 婷*，王佳佳，陳夏霖，曹 亮，王振中，肖 偉*

基于HPLC-Q-TOF-MS/MS技術的七味通痹口服液化學成分分析

唐 明1, 2，高 霞1, 2，耿 婷1, 2*，王佳佳1, 2，陳夏霖1, 2，曹 亮1, 2，王振中1, 2，肖 偉1, 2*

1. 江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇 連云港 222001 2. 中藥制藥過程新技術國家重點實驗室，江蘇 連云港 222001

采用高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜聯用技術（HPLC-Q-TOF-MS/MS）對七味通痹口服液中的化學成分進行定性表征。色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇?0.1%甲酸水溶液為流動相，梯度洗脫，體積流量1.0 mL/min，柱溫25 ℃；采用電噴霧離子源，正、負離子全掃描模式下采集數據，根據精確質荷比、二級碎片離子信息，結合對照品和文獻數據鑒定七味通痹口服液中的化學成分。共指認出七味通痹口服液制劑中72個化學成分，包括生物堿類、黃酮類、氨基酸類、酚酸類及苯丙素類等，其中18個化合物經對照品比對。該研究為七味通痹口服液的藥效物質基礎及質量控制的深入研究奠定了基礎。

七味通痹口服液；HPLC-Q-TOF-MS/MS；化學成分譜；生物堿類；黃酮類；酚酸類

七味通痹口服液是由螞蟻、青風藤、雞血藤、鹿銜草、石楠藤、千年健、威靈仙7味藥材組成，具有補腎壯骨、祛風蠲痹之功效，主治類風濕性關節炎證屬肝腎不足、風濕阻絡證[1]。目前，關于七味通痹口服液的研究側重于臨床療效和藥效機制等方面，對其全面的化學成分解析尚未見報道。中藥的化學成分復雜多樣，發揮藥理作用的活性成分種類眾多，具有多途徑、多靶點協同作用的藥效特征，這導致中藥復雜的化學成分研究成為中藥物質基礎研究和現代化發展中的重點和難點[2]。中藥藥效物質基礎是指中藥針對某一病癥發揮藥效作用的物質基礎總和，它是研究中藥藥效和作用機制的關鍵，也是中藥質量控制的基礎[3-4]。目前，中藥物質基礎研究方法主要包括：基于體內藥理活性追蹤并尋求中藥的有效部位（群）或最佳配伍；基于體外篩選與體外模型結合譜圖分析等技術，明確中藥的活性成分（群）；利用網絡藥理學篩選活性成分，尋求成分-靶點-基因的網絡結構，預測中藥藥效物質基礎和作用機制等[5]。這些研究所應用的技術主要包括化學成分分離、配伍和拆方分析、血清藥物化學、以活性為導向的藥效物質分離與篩選等；近些年來，代謝組學、譜效關系研究、多靶點高通量篩選、現代分子生物技術、網絡藥理學、結合基因表達譜芯片技術以及結合分子對接技術等也逐漸被廣泛應用[3,6-7]。無論使用何種技術，明確中藥的化學成分從而完善其物質基礎研究對控制中藥質量和闡明藥效物質基礎具有重要意義[8]。HPLC-Q-TOF- MS/MS分析技術是現在中藥成分研究領域中應用廣泛的定性測定方法，可以盡可能的檢測出中藥所含的化學成分，具有高速、高靈敏度以及高選擇性等特點[9]。本實驗運用HPLC-Q-TOF-MS/MS技術對七味通痹口服液的化學成分進行鑒定分析，為七味通痹口服液的質量控制以及藥效物質基礎的深入研究提供依據。

1 儀器與材料

Agilent 1290超高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Agilent 6538 QTOF質譜儀（美國安捷倫公司）；Centrifuge 5424R高速離心機（Eppendorf公司）；KH2200B型超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；Pacific TII7超純水儀（美國賽默飛公司）；Mettler Toledo ME303E型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；Mettler Toledo XS205DU型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

對照品木蘭花堿（批號R27J7F18588，質量分數≥98%）、刺芒柄花苷（批號RO4J6F2，質量分數≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；異槲皮苷（批號YH-140404）購自上海永恒生物科技有限公司；清風藤堿（批號Q-O82-161019，質量分數≥98%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；青藤堿（批號110774-200507）、-谷氨酸（批號111576- 200201）、苯丙氨酸（批號140676-200405）購自中國食品藥品檢定研究院，芒柄花素（批號111703-201504）、槲皮苷（批號111538-201606，質量分數90.6%）、沒食子酸（批號110831-201204，質量分數89.9%）、原兒茶酸（批號110809-201205，質量分數99.9%）、染料木苷（批號111709-201702，質量分數99.9%）、染料木素（批號111704-201302，質量分數99.1%）、腺嘌呤（批號110886-201102，質量分數99.4%）、水晶蘭苷（批號111870-201303，質量分數95.3%）、纈氨酸（批號140681-201202，質量分數99.6%）、-焦谷氨酸（批號100785-201402，質量分數99.7%）、5-羥甲基糠醛（批號11626-201610，質量分數100%）均購自中國食品藥品檢定研究院；七味通痹口服液（江蘇康緣陽光藥業有限公司，批號20180505）；甲醇、甲酸均為色譜級，水為超純水。

2 方法

2.1 檢測條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），洗脫梯度：0～10 min，1%～3% A；10～35 min，3%～20% A；35～50 min，20%～30% A；50～70 min，30%～55% A；70～75 min，55%～100% A；75～85 min，100% A。柱溫25 ℃；體積流量1.0 mL/min，進樣量5 μL。

2.1.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI），正、負離子模式檢測，離子掃描范圍設置為/50～1500；霧化氣壓力40 psi（1 psi≈6.895 kPa）；錐孔電壓65 V；裂解電壓135 V；毛細管電壓，正離子模式4000 V、負離子模式3500 V；干燥氣體積流量10.0 L/min；干燥氣溫度350 ℃；碰撞能量分別設定為10、20、30、40 V。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的制備 分別取木蘭花堿、異槲皮苷、5-羥甲基糠醛、清風藤堿、青藤堿、-谷氨酸、苯丙氨酸、芒柄花素、槲皮苷、沒食子酸、原兒茶酸、芒柄花苷、染料木苷、染料木素、腺嘌呤、水晶蘭苷、纈氨酸和-焦谷氨酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成含各成分10～30 mg/L的混合對照品溶液，14 000 r/min離心10 min，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 用移液管吸取1 mL七味通痹口服液于10 mL的量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，14 000 r/min 離心10 min，即得。

3 結果與分析

3.1 化合物數據庫的建立

查閱七味通痹口服液中7味組方藥材（螞蟻、青風藤、雞血藤、鹿銜草、石楠藤、千年健、威靈仙）的相關文獻，整理并建立化合物信息數據庫，包括化合物名稱、分子式、精確相對分子質量及所屬化學類型等信息。自建的數據庫中共收集了48個螞蟻中化合物、69個青風藤中化合物、119個雞血藤中化合物、24個鹿銜草中化合物、36個石楠藤中化合物、84個千年健中化合物、49個威靈仙中化合物。

3.2 成分鑒定

采用HPLC-Q-TOF-MS/MS技術，按2.1項下條件檢測供試品溶液和混合對照品溶液，對七味通痹口服液中化學成分進行定性分析，得到的正、負離子模式的總離子流圖（TIC），見圖1。

利用Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.04.00軟件生成的化合物分子式，選擇誤差在5×10?6以內的分子式與建立的數據庫進行匹配，推測出可能的化合物。采用Target模式對初步篩選的化學成分進行MS/MS檢測，精確輸入相應目標化合物的相對分子質量和保留時間，使用10、20、30和40 V不同碰撞能量進行樣品檢測，根據實驗結果選擇合適的碰撞能量值下的MS/MS信息進行結構推斷。共推測和鑒定出72個化合物，其中18個化合物經對照品比對驗證，結果見表1。

1、2、3、6、10、13、14、17號峰為氨基酸類化合物；8、34、40、44、45、50、55、59號峰為苯丙素類化合物；16、18、19、20、24、47號峰為酚酸類化合物；48、52、54、57、60、62～69號峰為黃酮類化合物；25～33、35～39、41、43、49、51、53、58、71號峰為生物堿類化合物；42、56、61、70號峰為萜類化合物；11號峰為核苷類化合物；22號峰為烷酸酯類化合物；72號峰為脂肪酸類化合物；4、5、7、9、12、15、21、23、46號峰為其他類化合物。

3.3 七味通痹口服液化學成分質譜裂解規律分析

3.3.1 氨基酸類化合物分析 氨基酸是一類含有酸性羧基和堿性氨基的有機化合物，各類植物和動物體內含量豐富。經文獻分析發現，螞蟻體內的蛋白質含量高達干質量的40%～67%[10,12]，游離氨基酸含量為1.88%，水解氨基酸含量為3.49%[12]，而在七味通痹口服液中其余6味藥材的化學成分研究中，尚未見氨基酸類成分的報道。因此，推測七味通痹口服液中該類化合物主要歸屬于螞蟻藥味。在正離子模式的一級質譜圖中，氨基酸類給出的準分子離子峰是[M＋H]+。MS/MS中氨基酸類的準分子離子峰 [M＋H]＋相對豐度較低，實驗結果發現正離子模式下大多數氨基酸失去NH3、HCOOH，與文獻報道[50-51]相符合。結合建立的數據庫和對照品比對，共推斷出8個氨基酸類成分，分別為賴氨酸（峰1）、精氨酸（峰2）、天冬氨酸（峰3）、谷氨酸（峰6）、纈氨酸（峰10）、焦谷氨酸（峰13）、亮氨酸（峰14）和苯丙氨酸（峰17），其中峰6、10、13和17經與對照品對照確認。

圖1 七味通痹口服液供試品TIC圖

表1 HPLC-Q-TOF MS/MS鑒定七味通痹口服液中的化學成分

續表1

續表1

*為與對照品比對的化合物

*compound comfirmed by standard

峰17經與對照品對照確定為苯丙氨酸。以峰17的解析為例了解氨基酸的質譜裂解規律。根據精確相對分子質量的準分子離子峰[M＋H]+/166.086 2推斷其可能為苯丙氨酸（C9H11NO2）；其碎片離子的裂解途徑如圖2所示，碎片離子/120.080 5（基峰，最穩定）為準分子離子峰脫去HCOOH所形成；/120.080 5離子脫去NH3得到/103.052 7碎片離子，其進一步脫去C2H2基團得到/77.039 5的碎片離子。峰2為無對照品的化合物，其準分子離子峰[M＋H]+/為175.119 3，給出化合物的分子式為C6H14N4O2，推斷其可能為精氨酸。其碎片離子的裂解途徑如圖3所示，精氨酸為直鏈型氨基酸，結構不穩定，準分子離子峰脫去NH3、CN3H5分別得到/158.094 8和/116.071 2碎片離子，其中其/116.071 2碎片離子進一步脫去HCOOH得到/70.065 1的碎片離子，故可指認其為精氨酸。

圖2 苯丙氨酸可能的裂解途徑

圖3 精氨酸可能的裂解途徑

3.3.2 酚酸類化合物分析 酚酸是一類簡單多酚類物質，結構中有一個芳香環，且環上有一至多個酚羥基取代[52]。在七味通痹口服液中該類化合物主要歸屬于鹿銜草、雞血藤和威靈仙等藥味。從碎片離子來看，該類化合物在負離子模式下響應較高且易丟失COO，在正離子模式下易丟失H2O。結合建立的數據庫和對照品比對，共推斷出6個酚酸類成分，分別為沒食子酸（峰16）、水楊酸（峰18）、異高熊果苷（峰19）、鹿蹄草素（峰20）、原兒茶酸（峰24）和異阿魏酸（峰47），其中峰16和24經與對照品對照確認。

峰24經與對照品對照確定為原兒茶酸。以峰24的解析為例了解酚酸的質譜裂解規律。根據精確分子量的準分子離子峰 [M－H]?/153.019 7推斷其可能為原兒茶酸（C7H6O4）；其碎片離子/109.027 2（基峰，最穩定）為準分子離子峰脫去COO所形成。峰18為無對照品的化合物，其準分子離子峰[M－H]?/為137.024 4，給出化合物的分子式為C7H6O3，推斷其可能為水楊酸。其準分子離子峰脫去COO得到/93.044 6碎片離子，故可指認其為水楊酸。

3.3.3 黃酮類化合物分析 黃酮類化合物是一類存在于自然界的、具有2-苯基色原酮結構的化合物。在七味通痹口服液中該類化合物主要歸屬于雞血藤、鹿銜草和威靈仙等藥味。從碎片離子來看，黃酮結構中的C環易發生RDA（Retro-Diels-Alder）裂解反應，即斷裂主要發生在C1與C2位和C3與C4位，產生A環和B環2個碎片離子。若化合物中有甲氧基存在時，化合物首先失去甲基，然后化合物的C環丟失碎片CO等。另外，黃酮苷類化合物在二級質譜中大多是脫去糖基形成苷元離子，而且脫去糖基的黃酮苷元，和相對應的黃酮類化合物的裂解規律一致[53]。結合建立的數據庫和對照品比對，共推斷出13個黃酮類成分，分別為染料木苷（峰48）、異槲皮苷（峰52）、8--β--葡萄糖基山柰酚-3--β--葡萄糖苷（峰54）、槲皮苷（峰57）、芒柄花苷（峰60）、山柰酚/木犀草素（峰62）、杜鵑素（峰63）、大豆苷元（峰64）、毛蕊異黃酮/櫻黃素（峰65）、染料木素（峰66）、6-hydroxybiochainA（峰67）、苜蓿素（峰68）和芒柄花素（峰69），其中峰48、52、60、66和69經與對照品對照確認。

峰48和峰66經與對照品對照確定為染料木苷和染料木素。以峰48和峰66的解析為例了解黃酮苷和黃酮苷元的質譜裂解規律。根據峰66的精確相對分子質量的準分子離子峰[M＋H]+/271.060 1推斷其可能為染料木素（C15H10O5）；其碎片離子的裂解途徑如圖4所示，準分子離子峰脫去CO得到/243.064 3碎片離子，接著繼續脫去CO得到/215.062 5碎片離子，黃酮結構中的C環易發生RDA 裂解反應得到/153.126 3碎片離子。根據峰48的精確相對分子質量的準分子離子峰[M＋H]+/433.113 2推斷其可能為染料木苷（C21H20O10）；其碎片離子的裂解途徑如圖4所示，準分子離子峰脫去C6H10O5得到/271.060 1碎片離子，接著分別脫去2個CO得到/243.063 5和/215.079 4碎片離子，黃酮結構中的C環發生RDA裂解反應得到/153.017 1碎片離子，裂解規律同峰48一致。

圖4 染料木苷和染料木素可能的裂解途徑

3.3.4 生物堿類化合物分析 生物堿類化合物大多數有復雜的環狀結構，有顯著的生物活性，是中草藥中重要的有效成分之一，在七味通痹口服液中該類化合物主要歸屬于青風藤、石楠藤和威靈仙等藥味。結合建立的數據庫和對照品比對，共推斷出21個生物堿類成分，分別為4-hydroxy-3,6- dimethoxyl-17（峰25）、尖防己定堿（峰26）、青藤堿（峰27）、尖防己堿（峰28）、雙青藤堿（峰29）、穆坪馬兜鈴酰胺（峰30）、假畢撥酰胺A（峰31）、dauricumine（峰32）、土藤堿（峰33）、木蘭花堿（峰35）、7-乙氧基-3-吲哚碳酸甲酯（峰36）、異青藤堿（峰37）、清風藤堿（峰38）、四氫巴馬汀（峰39）、碎葉紫堇堿（峰41）、蝙蝠葛波酚堿（峰43）、青風藤定堿（峰49）、表小檗堿（峰51）、8,14-二氫薩魯塔里定堿（峰53）、--香豆酰酪胺（峰58）和蝙蝠葛寧堿（峰71），其中峰27、35和38經與對照品對照確認。

制劑中檢測到的生物堿主要是芐基異喹啉類生物堿，其中按生物堿骨架又分為阿樸啡類、嗎啡烷類和小檗堿類。以嗎啡烷類和阿樸啡類生物堿為例，嗎啡烷類生物堿易斷裂含氮的環狀結構，然后失去氮及其連接的取代基形成[M＋H－NH3]+、[M＋H－NH2CH2]+和[M＋H－NHCH2CH2]+的碎片[54-55]，此外，苯環上也易失去CH3OH形成含氧三元環，同時含氧三元環易轉化為羰基，緊接著失去羰基導致苯環減少1個碳形成五元環[56]。阿樸啡類生物堿也易失去氮及其連接的取代基[52-53]，苯環上的裂解規律與嗎啡烷類生物堿類似[55]。

峰27經與對照品對照確定為青藤堿（嗎啡烷類）。以峰27的解析為例了解生物堿的質譜裂解規律。根據峰27的精確相對分子質量的準分子離子峰[M＋H]+/330.170 5推斷其可能為青藤堿（C19H23O4）；其碎片離子的裂解途徑如圖5所示，準分子離子峰脫去CH2CHNHCH3和苯環上的CH3OH得到/241.088 4碎片離子，接著分別脫去CO、CH4O、2H得到/為213.093 2、209.061 5、239.072 9的碎片離子，其中/為213.093 2的碎片離子繼續脫去CH3OH形成/為181.066 7的碎片離子，/為239.072 9的碎片離子同樣脫去CH3OH形成/為207.046 1的碎片離子。

峰33為無對照品的化合物，其準分子離子峰[M＋H]+/為298.143 6，給出化合物分子式為C18H19NO3，推斷其可能為土藤堿（阿樸啡類）。其碎片離子的裂解途徑如圖6所示，準分子離子峰脫去NH3得到/281碎片離子，接著苯環上相鄰的2個甲氧基脫去CH4形成五元環，得到/265碎片離子，故可指認其為土藤堿。

4 討論

本實驗采用HPLC-Q-TOF-MS/MS技術，利用MassHunter軟件給出的準分子離子信息，結合化合物數據庫、二級碎片離子信息以及與18個對照品比對，并參考相關文獻資料，實現了七味通痹口服液中的72個化合物的快速辨析與歸屬。所推測和鑒定的化合物中涵蓋了21個生物堿、13個黃酮、8個氨基酸、8個苯丙素、6個酚酸、4個萜類、1個核苷、1個脂肪酸、1個烷酸酯和9個其他類等多種類型的化合物。實驗前期對色譜和質譜條件均進行了全面系統地優化，包括色譜柱、有機相、流動相pH值、洗脫梯度及碎裂電壓等，確定了上述最佳檢測條件。此外，還考察了樣品提取溶劑和超聲時間的影響，發現以純水作為提取溶劑時色譜峰的數目相對較多，分離效果較佳，超聲時間對色譜圖幾乎無影響，從而確定了上述最適宜的供試品制備方法。盡管對檢測和提取方法均進行了充分考察，但是七味通痹口服液的制劑生產過程中添加了千年健的揮發油，由于本研究檢測條件的限制，僅檢測到了3個揮發油類成分，因此，在今后的研究過程中，可以采用GC-MS等技術對制劑中揮發性成分進行進一步研究，使制劑中的揮發油類化學成分更加明確。本實驗首次運用HPLC-Q-TOF-MS/MS技術，對七味通痹口服液的化學成分進行了全面系統地解析，并研究總結了氨基酸類、核苷類、黃酮類和生物堿類化合物在質譜中的裂解規律，為七味通痹口服液的藥效物質基礎和質量控制的深入研究提供了實驗及理論依據。

圖5 青藤堿可能的裂解途徑

圖6 土藤堿可能的裂解途徑

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Identification of chemical constituents in Qiwei Tongbi Oral Liquid by HPLC-Q-TOF-MS/MS

TANG Ming1, 2, GAO Xia1, 2, GENG Ting1, 2, WANG Jia-jia1, 2, CHEN Xia-lin1, 2, CAO Liang1, 2, WANG Zhen-zhong1, 2, XIAO Wei1, 2

1. Jiangsu Kanion Parmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China 2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China

To study the chemical constituents of Qiwei Tongbi Oral Liquid (七味通痹口服液) by using high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (HPLC-Q-TOF-MS/MS).The analysis was performed on Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm) column. The mobile phase consisted of methanol and 0.1% formic acid aqueous solution was used as gradient elution. The flow rate was 1.0 mL/min and column temperature was 25 ℃. The mass spectrometry was acquired in both negative and positive ion modes by using electron spray ionization (ESI). These components were further analyzed based on high-resolution mass-to-charge ratios, fragment ion species and other information combined with reference substance and literature data.A total of 72 compounds were identified and predicted, including alkaloids, flavonoids, amino acid, phenolic acids and phenylpropanoids, of which 18 compounds were verified by reference substances.This study lay the foundation for elucidating its active components, and provide reference for the quality control of Qiwei Tongbi Oral Liquid.

Qiwei Tongbi Oral Liquid; HPLC-Q-TOF-MS/MS; chemical composition spectrum; alkaloids; flavonoids; phenolic acids

R284.1

A

0253 - 2670(2021)08 - 2226 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.08.005

2020-11-07

江蘇省自然科學基金-青年基金資助項目（BK20180268）；江蘇省工信廳2020年度工業和信息產業轉型升級專項資金項目（多組分中藥研究關鍵技術）

唐 明，碩士研究生。Tel: 18851101081 E-mail: tangming199408@163.com

肖 偉，博士，研究員級高級工程師，從事中藥新藥的研究與開發。Tel: (0518)81152367 E-mail: kanionlunwen@163.com

耿 婷，博士，從事中藥化學成分和藥代動力學研究。Tel: 18001598290 E-mail: yilinger110@126.com

[責任編輯 王文倩]