全基因組關聯分析在蔬菜育種研究中的應用

曾美娟 劉建汀 卓玲玲 陳敏氡 葉新如 王 彬 朱海生 溫慶放

（福建省蔬菜遺傳育種重點實驗室，福建省農業科學院作物研究所，福建省蔬菜工程技術研究中心，福建福州 350013）

隨著20 世紀80 年代初基于DNA 的分子標記和80 年代末先進的統計工具的出現，挖掘控制數量性狀的基因組區域成為可能。挖掘控制數量性狀基因組的方法包括數量性狀座位（quantitative trait locus，QTL）區間定位和全基因組關聯分析（genome-wide association study，GWAS）。傳統的QTL 定位高度依賴于雙親的遺傳多樣性，檢測到QTL 效率因群體而異。QTL 區域也可能相當大，包含太多的基因，很難作為潛在的候選基因進行研究。此外，QTL 定位往往需要構建作圖群體，耗時較長且定位精度不高（Rafalski，2010）。GWAS可以在一定程度上克服QTL 分析的局限性，它可以利用自然群體縮小候選區域，同時對多個性狀進行分析（Yu &Buckler，2006；Huang &Han，2014），以降低分析誤差（曹英杰 等，2019），極大地提高育種效率。全基因組關聯分析高效地將表型和基因型進行關聯并用于遺傳作圖和搜尋相關性狀候選基因（Gajardo et al.，2015；闕青敏 等，2019），可同時對多個復雜性狀進行關聯，檢測多個等位基因，適用于定位性狀關聯區間，功能基因研究，開發性狀選育標記等，具有高分辨率和高通量等優點，在蔬菜育種研究中的應用日益廣泛。全基因組關聯分析在揭示蔬菜復雜性狀的分子機理和蔬菜分子育種中起到重要的作用（李廷雨 等，2020）。

1 全基因組關聯分析

1.1 概述

全基因組關聯分析是近年來興起的遺傳分析方法，其以連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）為基礎，通過識別數百個或數千個個體定位群體中高密度的分子標記，一般是上萬個甚至上百萬個單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）標記，篩選出與復雜性狀表現型變異相關聯的分子標記（Du et al.，2018）。換言之，通過關聯分析分子標記與性狀變異，對群體中的個體進行大規模的基因分型和表型分析，從而識別導致個體之間表型差異的基因組區域（Hirschhorn &Daly，2005；Huang et al.，2010；Zhao et al.，2011）。連鎖不平衡是指群體內不同位點上等位基因間的非隨機關聯（曹英杰 等，2019）。連鎖不平衡是GWAS分析的基礎（Abecasis &Cookson，2000），受多因素的影響，不同物種間基因組中連鎖不平衡也存在顯著差異。高LD 水平的群體，能夠縮減GWAS分析時所需的群體數量。近年來，隨著以SNP 為代表的第3 代分子標記技術的發展，大大加快了GWAS 的發展速度，幾千甚至幾百萬個標記被用于1 個GWAS，在人類和動植物復雜性狀遺傳研究中已取得初步成果（段忠取和朱軍，2015），亦已成功應用于多種作物的重要農藝性狀的遺傳研究（Elshire et al.，2011；趙振卿 等，2014；He et al.，2014）。

1.2 分析策略和常用軟件

GWAS 應用于植物育種的研究策略主要包括以下幾方面：①選擇植物群體材料。群體規模太大，性狀調查費用和基因型檢測費用均會相應增多。選擇表型齊全和遺傳變異豐富的研究群體可以減少所需群體內的個體數目，提高關聯分析的分辨率。②表型鑒定。設計合理的田間試驗，多年多點種植試驗材料和多區域重復隨機調查表型性狀，并將調查結果進行整合（劉坤 等，2018）。③基因型的測定。獲取選定試驗材料的全基因組SNP 位點，從而實現基因型分析（Seki et al.，2005；Rutkoski et al.，2013；韓德鵬 等，2018）。④ 關聯分析。對選定試驗群體進行群體結構分析，選用合適的統計分析模型對基因型與表型進行分析（Raman et al.，2019；孫程明 等，2020）。涉及質量性狀關聯分析時，通常可以采用Logistic 回歸模型進行分析；涉及數量性狀時，通常可采用普通線性回歸模型（卜李那和趙毅強，2019），但數量性狀通常受到多種因素的共同影響，在研究過程中通常采用不同的混合模型（表1）。⑤ 候選基因篩選（姜洪真 等，2018）。

表1 近年來部分GWAS 中采用的混合模型方法及其特點

目前分析過程涉及的軟件很多，其中PLINK軟件（Purcell et al.，2007）是較早使用的關聯分析軟件，它可用于復雜數量性狀、關聯作圖、數據轉化與處理、LD 分析、單倍型檢驗等。采用SAMTOOLS 軟件（Li et al.，2009）檢測、過濾SNP，采用ANNOVAR 軟件（Wang et al.，2010）對檢測到的SNP 進行注釋，采用GCTA 軟件（Yang et al.，2011）對群體進行主成分分析、單性狀和兩相關性狀關聯分析，采用STRUCTURE 軟件（Evanno et al.，2005；王艷玲 等，2017；Volante et al.，2017）對群體結構進行分析。采用GEMMA 軟件（Zhou &Stephens，2012）基于SNP 進行關聯分析。采用TASSEL 軟件（Bradbury et al.，2007）進行各種模型的關聯分析，估算LD 值和作圖、估測群體結構和繪制基于遺傳距離的樹狀圖等。GAPIT 軟件（Lipka et al.，2012）用于BLUP 基因組預測關聯分析和BLUP 基因組預測。

2 全基因組關聯分析在蔬菜育種研究中的應用

2.1 蔬菜生長發育過程相關性狀應用研究

前人在蔬菜生長發育過程相關性狀方面，如黃瓜發芽期、黃瓜幼苗階段、白菜類作物抽薹開花、菠菜雌雄同株、普通菜豆相關性狀的控制基因等方面都開展了全基因組關聯分析。張松等（2019）對黃瓜發芽期進行全基因組關聯分析，檢測到5 個與相對發芽率關聯的位點，2 個與相對發芽勢關聯的位點，2 個與相對發芽指數關聯的位點，2 個與相對胚根長度關聯的位點。蔡和序等（2020）對黃瓜幼苗下胚軸長度進行全基因組關聯分析，通過分析關聯SNP 位點的LD 區間序列，獲得Csa1G074930、Csa1G475980、Csa2G381650、Csa3G141820、Csa4G051570、Csa3G627150、Csa5G174640、Csa6G362970等8 個與黃瓜下胚軸長度有關的候選基因，其中既有光形態建成、泛素化、激素信號通路等調控基因，也有調控網絡下游參與細胞生長發育，調節細胞大小，直接調控黃瓜下胚軸長度的基因。抽薹開花是白菜類作物關鍵的農藝性狀。白菜類作物主要包括大白菜、普通白菜、蕪菁等。挖掘白菜類作物抽薹開花調控位點和基因，對白菜類作物的培育具有重要的意義。龔振平（2016）對182份大白菜自然群體晚抽薹性狀進行全基因組關聯分析，獲得5 個與耐抽薹性狀顯著關聯的位點，為進一步發掘相關性狀的候選基因提供了依據。高寶禎等（2017）通過全基因組關聯分析鑒定出33 個與白菜類作物開花時間相關的顯著關聯信號。通過定位出的開花時間候選位點，再根據白菜類作物與同源物種擬南芥的基因共線性關系以及基因功能注釋結果初步鑒定出與14 個白菜類作物開花時間相關的候選基因。汪豪英等（2019）通過對82 份菠菜高代自交系的全基因組關聯分析，采用壓縮混合線性模型在菠菜4 號染色體上檢測到1 個強關聯區域，并將控制菠菜雌雄同株的基因Xm定位在64.6 kb 的區間內。該范圍內存在3 個基因：Spo24600、Spo24601和Spo24602。最近，Wu 等（2020）對來自19 個國家的683 份普通菜豆資源的全基因組進行重測序，發掘出超過480 萬個SNP，構建出國際首張精細的普通菜豆單倍型圖譜，鑒定出505 個與主要農藝性狀緊密相關的遺傳位點。

上述研究表明采用全基因組關聯分析能夠有效鑒定蔬菜生長發育過程相關農藝性狀的關鍵遺傳位點。因為蔬菜作物的農藝性狀往往都是由多個基因控制且受環境影響，與單基因控制的性狀相比，其遺傳基礎更為復雜。而全基因組關聯分析是經典的定量遺傳理論的拓展，采用全基因組關聯分析的方法能夠既簡單且快速地鑒定出蔬菜作物控制發育過程相關性狀的重要基因，對蔬菜作物農藝性狀相關基因的研究以及輔助育種具有重大意義。

2.2 蔬菜品質和產量性狀應用研究

在蔬菜品質和產量性狀方面，如番茄的果實質量、果實硬度、心室數目、果形指數、代謝物含量以及辣椒的辣椒素含量等相關性狀的控制基因都開展了全基因組關聯分析。Xu 等（2013）利用關聯分析的方法對44 份栽培種番茄、127 份櫻桃番茄和17 份醋栗番茄的果實質量、果實硬度、心室數目等性狀進行了初步研究，共檢測到40 個位點，其中果實質量、心室數目、可溶性固形物等性狀的主效位點信號區域都有相關的功能基因。祝光濤（2015）利用843 316 個位點對253 個番茄栽培種亞群中的果實顏色、果實質量和果形指數等5 個性狀進行關聯分析，發現了11 個明顯的關聯信號位點，其中1 個果皮顏色位點、2 個果形指數位點和2 個心室數目位點和前人的研究結果一致，另外6個位點為新發現的位點。Bauchet 等（2017）借助10 000 個SNP 標記對300 份番茄的60 種初級和次級代謝產物開展了全基因組關聯分析，確定了79個與13 個初級代謝產物和19 個次級代謝產物高度關聯的位點。同時，還發現了4 個基因組區域可控制幾種代謝物變異，并發掘了決定代謝物含量的候選基因，揭示了番茄亞種復雜而獨特的代謝物調控機理。趙建濤（2016）利用混合線性模型對番茄果實中主要的17 種糖酸組分進行全基因組關聯分析，共檢測到139 個顯著關聯位點，除了蘇糖醇外，在其他16 個糖酸物質上至少檢測到1 個顯著關聯位點。Sauvage 等（2014）利用多位點混合模型對163 份番茄種質進行關聯分析，利用遍布全基因組的5 995 個SNP 位點對影響番茄品質的76 種代謝物質進行了分析，檢測到了控制19 個性狀的44 個顯著位點。Nimmakayala 等（2016）使用7 331 個SNP 標記對辣椒性狀進行研究，發現72 個SNP 標記與辣椒素含量相關，包括1 個候選基因，該基因編碼一種具有與CS 相似的酰基轉移酶功能的錨蛋白樣蛋白。Han 等（2018）通過QTL 定位和GWAS 挖掘控制辣椒中辣椒素含量的候選基因，共檢測到69 個QTL 區域，其中10 個區域與2 個雙親群體的QTL 位于同一位置。在這些區域中，鑒定出5 個已知參與辣椒素生物合成的候選基因。

隨著人們生活水平逐步提高，多樣化的蔬菜品種給予了大眾更多的選擇，大眾對蔬菜品質的要求則越來越高。在蔬菜育種中，品質高低影響著該品種能否適應市場以及滿足消費者的需求。蔬菜品質育種也是蔬菜遺傳改良的重點。同時，蔬菜產量的高低也影響著其經濟價值，通過全基因組關聯分析來開展蔬菜品質和產量性狀的相關研究對蔬菜品質和產量的提升具有重要意義。

2.3 蔬菜抗性性狀應用研究

為有效控制蔬菜病害的發生與危害，選育和利用具有相關抗性的蔬菜品種也是育種的關鍵。隨著全基因組學的發展，全基因組關聯分析也在馬鈴薯抗晚疫病、大白菜抗霜霉病、瓠瓜抗白粉病、黃瓜抗低溫等蔬菜抗性相關基因的挖掘中得到應用。為了明確馬鈴薯晚疫病抗性的穩定性與標記間的關聯，Lindgvist-Kreuze 等（2014）結合田間晚疫病表型數據，對適應熱帶高地的馬鈴薯群體的基因型進行全基因組關聯分析，發現第9 號染色體上的SNP標記與馬鈴薯晚疫病抗性相關，且與穩定性有關。龔振平（2016）對182 份自交系材料組成的大白菜自然群體開展5 種病害的全基因組關聯分析，分別獲得與霜霉病（2 個）、病毒病（5 個）、黑腐病（2 個）、黃萎病（5 個）和根腫病（8 個）抗性顯著關聯的22 個位點或熱點區。吳曉花等（2020）利用兩年的抗病表型數據，對117 份瓠瓜微核心種質的白粉病抗性進行研究，通過全基因組關聯分析，分別獲得22 個和13 個與白粉病抗性相關的SNP 標記。王偉平等（2019）以黃瓜核心種質為材料開展苗期耐低溫鑒定和篩選，并進行全基因組關聯分析，挖掘耐低溫相關位點。在1、3、4、5 號染色體上分別檢測到苗期耐低溫位點gLTS1.1、gLTS3.1、gLTS4.1和gLTS5.1。魏爽等（2019）進行了黃瓜苗期耐熱性篩選，通過全基因組關聯分析共檢測到7 個與苗期耐熱性相關位點gHII4.1、gHII5.1、gHII5.2、gHII6.1、gHII7.1、gHII4.2、gHII6.2。

施用化學藥劑能夠在一定程度上控制相應的病蟲危害，但也帶來環境污染等問題，同時增加農民種植成本，產生蔬菜安全問題。通過全基因組關聯分析，將這些性狀關聯標記用于蔬菜分子輔助育種，有助于選育出具有抗性的蔬菜品種。而選育具有抗性的蔬菜品種又是目前防治相應病害、適應不佳種植環境及選育反季蔬菜較為經濟、有效的方法。

3 展望

傳統的QTL 定位高度依賴于雙親的遺傳多樣性，檢測到的QTL 效應因群體而異。QTL 區域也可能相當大，包含太多的基因，而利用全基因組關聯分析（GWAS）可以利用自然群體縮小候選區域，在一定程度上克服QTL 分析的局限性。當然，GWAS 的應用也存在一定的局限性，例如在自花授粉作物中，用GWAS 定位性狀相關基因難以達到單基因水平，一些群體結構因素易導致假陽性，非遺傳因素產生的表型變化導致的假陽性以及基因與環境的互作效應亦會影響GWAS 結果（Stacey &Joanna，2013）。為獲得更精準的GWAS 結果，研究人員需對群體結構加以準確分析，通過增大群體規模來盡可能減少假陽性。相關技術的不斷更新也將在一定程度上降低群體結構的干擾。同時，也有必要對結果進行驗證（Zhu et al.，2008；Korte &Farlow，2013）。由于每種方法都有其局限性，將不同方法進行聯合，取長補短可在一定程度上提高分析結果的準確性。已有研究表明，QTL 定位聯合GWAS 是鑒定控制復雜性狀的基因位點的一種強有力的組合方法（Han et al.，2018）。

GWAS 只識別與目標性狀相關的基因組區域，而不是發現基因，一個性狀相關的基因組區域內會有許多標記（例如，多個SNP 標記）。隨著下一代測序技術的發展，幾千甚至幾百萬個標記被用于1個GWAS，每個GWAS 可用的標記數量大幅增加，SNP 集被應用于GWAS 是當前的關鍵研究領域，也將促進GWAS 的發展。近年來，GWAS 研究取得了重大進展，這些性狀關聯標記也被有效地用于標記輔助選擇，以補充傳統的蔬菜育種方法，改良簡單和復雜的數量性狀。GWAS 將極大推動蔬菜由傳統育種向高效、定向的分子設計育種轉變，亦將為揭示蔬菜主要農藝性狀、品質性狀和抗性性狀的分子機理發揮重要的作用。