沙棘多糖抑制PERK/ATF4/CHOP 通路緩解糖尿病大鼠胰島素抵抗和肝腎功能損傷

姚蘭，蔣成霞，郭艷艷，游成珊，李梅，葉序卷

宜賓市第二人民醫院內分泌科，四川 宜賓 644000

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是胰島素分泌不足或作用缺陷引起的代謝性疾病，嚴重威脅人類健康。長期的高血糖可引起心血管病、腦血管病、糖尿病、腎病等并發癥。糖尿病的臨床治療藥物會產生多種副作用，而中藥成分往往具有多種生物活性，并有低毒、經濟的特點。沙棘多糖（seabucthorn polysaccharide，SP）提取于胡頹子科沙棘屬的灌木植物，具有調節血糖、降低膽固醇等功能[1,2]。研究顯示，PERK/ATF4/CHOP 通路在糖尿病的發展中發揮重要作用，可能是治療糖尿病的關鍵通路[3]。筆者推測沙棘多糖可調控糖尿病發展，并可能與PERK/ATF4/CHOP 通路活性存在關聯，通過研究沙棘多糖對Ⅱ型糖尿病大鼠胰島素抵抗、肝腎損傷以及PERK/ATF4/CHOP 通路活性的影響，為沙棘多糖治療糖尿病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性SD 大鼠，體重180～220 g，由中國醫學科學院實驗動物研究所提供，鹽酸羅格列酮（rosiglitazone，RSG）購自中國食品藥品檢定研究院（批號：100801-201301），沙棘多糖（SP）由內蒙古農業大學生命科學學院提供，鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）購自美國Sigma 公司。大鼠糖化血紅蛋白（HbA1c）ELISA 試劑盒購自上海羽朵生物公司，大鼠脂聯素ELISA 試劑盒購自上海酶聯生物公司，胰島素ELISA 試劑盒購自廈門慧嘉生物公司，本研究抗體均購自CST 公司。全自動生化測定儀購自日本日立公司，血糖測定儀購自美國強生公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物處理 隨機取10 只大鼠作對照組，將剩余50 只大鼠作造模組，對照組給予普通飼料，造模組給予高脂高糖飼料并腹腔注射1%鏈脲佐菌素30 mg·kg-1誘導Ⅱ型糖尿病，連續飼喂8 周。當造模組大鼠血糖≥11.1 mmol/L，表示造模成功。隨機將造模大鼠分為：STZ 組、RSG 組（4 mg·kg-1·d-1）、SP 低、中、高劑量組（50、100、200 mg·kg-1·d-1），每組10 只，并按分組情況進行藥物處理，對照組與STZ 組每天注射等體積生理鹽水，連續處理8 周。給藥期間，造模組大鼠以高脂高糖飼料喂養，對照組以基礎飼料喂養。

1.2.2 大鼠各指標檢測 通過電子天平稱取大鼠體重和雙側腎重量，計算腎肥大指數，腎肥大指數（mg/g）=腎重量（g）/體重（g）×1000。使用血糖測定儀檢測大鼠空腹血糖（FBG）濃度。ELISA 試劑盒檢測大鼠HbA1c、脂聯素、空腹胰島素含量，并計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR=FBG×Fins/22.5）。自動生化分析儀檢測大鼠甘油三酯水平（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）、尿蛋白（PRO)、血肌酐（SCR）、尿素氮（BUN）水平。

1.2.3 油紅O 染色 使用冰凍切片機將肝切成5 μm厚度切片，室溫下干燥5 min，10%福爾馬林固定10 min，60%異丙醇同化5 min，油紅O 染色10 min，85%丙二醇洗滌5 min，蘇木精復染30 s，洗去浮色，水溶性封片膠封片，顯微鏡下觀察。

1.2.4 HE 染色 將大鼠腎切片在二甲苯中脫蠟，再經梯度酒精水化。將切片置于蘇木紫溶液中染色5 min 后，將切片放于0.5%鹽酸乙醇中分化30 s，自來水沖洗15 min，放入伊紅染色2 min，蒸餾水漂洗，經梯度乙醇脫水5 min，最后轉移入二甲苯中透明處理10 min，中性樹膠封固，觀察切片組織形態。

1.2.5 Western Blot 檢測 將各組小鼠肝組織進行充分勻漿、裂解，離心后取上清液。蛋白經電泳分離蛋白后轉印蛋白質至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別孵育一抗、二抗，PBST 洗脫后，加入BCL，進行曝光。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 沙棘多糖下調糖尿病大鼠血糖濃度

如圖1 所示，與對照組相比，STZ 組、SP 低、中、高劑量組體重均下降（P＜0.05）；與STZ 組相比，RSG 組、SP 中、高劑量組體重均上升（P＜0.05）。血糖檢測結果顯示，沙棘多糖可下調大鼠血糖濃度，且中、高劑量組效果尤為顯著。

2.2 沙棘多糖緩解大鼠胰島素抵抗

如圖2 所示，相對于STZ 組，SP 各組大鼠胰島素抵抗指數、HbA1C、血漿胰島素含量下調，且SP 中、高劑量組效果顯著（P＜0.05）；此外，中、高劑量沙棘多糖可顯著上調脂聯素含量（P＜0.05）。提示，沙棘多糖能改善大鼠胰島素抵抗。

2.3 沙棘多糖緩解大鼠肝細胞脂肪沉積

如圖3A～D 所示，沙棘多糖可下調糖尿病大鼠TC、TG、LDL-C 含量，同時上調HDL-C 含量，且中、高劑量沙棘多糖效果顯著（P＜0.05）。如圖3E 所示，油紅O 染色結果表明STZ 組和SP 低劑量組大鼠肝存在大量脂肪沉積，而對照組、RSG 組、SP 中、高劑量組中脂肪沉積量少。提示沙棘多糖可減少糖尿病大鼠肝脂肪沉積。

2.4 沙棘多糖緩解糖尿病大鼠腎損傷

如圖4A～D 所示，沙棘多糖可下調糖尿病大鼠腎肥大指數、PRO、SCR、BUN 水平，且中、高劑量沙棘多糖效果顯著（P＜0.05）。如圖4E 所示，STZ 組與SP 低劑量組大鼠腎可見部分腎小球細胞核固縮、碎裂溶解，腎小球血管袢腫脹斷裂，腎小管上皮細胞腫脹，空泡變性。隨沙棘多糖濃度增加，大鼠腎損傷程度逐漸降低。

2.5 沙棘多糖抑制PERK/ATF4/CHOP 通路活性

圖1 沙棘多糖對糖尿病大鼠體重及血糖濃度的影響A：SP 中、高劑量使糖尿病大鼠體重上升 B：SP 中、高劑量使糖尿病大鼠血糖下降*P＜0.05，與對照組比較#P＜0.05，與STZ 組比較Fig.1 Effects of Seabucthorn Polysaccharide on body weight and blood sugar concentration in diabetic ratsA：Medium and high doses of Seabucthorn Polysaccharide increased the body weight of diabetic rats; B: Medium and high doses of Seabucthorn Polysaccharide reduced the blood sugar concentration in diabetic rats;* P＜0.05 compared with the control group;#P＜0.05 compared with the STZ group

圖2 沙棘多糖對糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響A：沙棘多糖下調糖尿病大鼠胰島素抵抗指數 B：沙棘多糖下調糖尿病大鼠HbA1C 比率 C：沙棘多糖上調糖尿病大鼠血漿脂聯素水平 D：沙棘多糖下調糖尿病大鼠血漿胰島素水平 *P＜0.05，與對照組比較 #P＜0.05，與STZ 組比較Fig.2 Effects of Seabucthorn Polysaccharide on insulin resistance in diabetic ratsA: SP down-regulated insulin resistance index in diabetic rats; B:SP down-regulated the ratio of HbA1C in diabetic rats; C: SP upregulated the level of Plasma adiponectin in diabetic rats;D:SP down-regulated the level of P-insulin in diabetic rats;*P＜0.05 compared with control group;#P＜0.05 compared with STZ group

如圖5 所示，沙棘多糖可下調p-PERK/PERK 比值、ATF4、CHOP 蛋白表達量，且中、高劑量沙棘多糖效果顯著（P＜0.05）。由此可見，沙棘多糖可抑制PERK/ATF4/CHOP 通路活性。

3 討論

目前主要采用西藥治療糖尿病，但長期使用會產生副作用。隨著對中藥研究的深入，中藥提取物低毒、安全、生物活性廣泛的特點逐漸被學者們所認知。因此，尋找中藥治療糖尿病或將成為糖尿病研究的新方向。

沙棘多糖是沙棘中具有生物活性的重要成分，沙棘提取物具有降低血糖的作用[4]。Song 等[2]研究發現，沙棘可降低高脂飲食大鼠血清TC、TG、LDL-C 水平，減少肝細胞的脂肪變性。沙棘葉提取物可以增加能量消耗，抑制高脂肪飲食小鼠肝脂肪的生成，并增強肝脂肪酸氧化以改善肝脂肪變性，同時抑制抵抗素和促炎細胞因子的分泌，改善胰島素敏感性[5]。因此，筆者推測沙棘多糖對糖尿病具有治療作用，為此使用沙棘多糖治療糖尿病模型大鼠。實驗結果顯示，SP 中、高組糖尿病大鼠血糖、血漿胰島素、糖化血紅蛋白含量和胰島素抵抗指數下降，而體重和脂聯素含量增加，這提示沙棘多糖具有調控血糖、抑制糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用，與已有的相關研究結果一致。

肝調節是糖脂代謝的重要器官。糖尿病患者常具有肝酶、膽紅素、白蛋白含量異常及肝脂肪變性、血脂水平升高等肝功能異常表現，進而發展為脂肪肝、肝硬化，甚至肝癌。有報道稱，肝脂肪變性主要發生于Ⅱ型糖尿病患者，控制Ⅱ型糖尿病是控制非酒精性脂肪肝發生的重要手段[6]。本研究結果顯示，沙棘多糖可下調糖尿病大鼠TC、TG、LDL-C 含量，上調HDL-C 含量，同時減少模型大鼠肝中的脂肪沉積。這提示，沙棘多糖可降低糖尿病大鼠血脂水平，同時緩解肝脂肪沉積。

圖3 沙棘多糖對糖尿病大鼠血脂水平和肝脂肪沉積的影響A：沙棘多糖下調糖尿病大鼠血清TC 水平 B：沙棘多糖下調糖尿病大鼠血清TG 水平 C：沙棘多糖下調糖尿病大鼠血清LDL-C 水平 D：沙棘多糖上調糖尿病大鼠血清HDL-C水平 E：沙棘多糖減少糖尿病大鼠肝油脂沉積 *P＜0.05，與對照組比較 #P＜0.05，與STZ組比較Fig.3 Effects of seabucthorn polysaccharide on blood lipid level and liver fat deposition in diabetic ratsA: SP down regulated the serum total cholesterol level in diabetic rats; B: cholesterol the serum triglyceride levels in diabetic rats; C: SP down-regulated the serum low density lipoprotein cholesterol levels in diabetic rats; D: SP up regulated the serum high density lipoprotein cholesterol levels in diabetic rats; E: SP increased the liver lipid deposition in diabetic rats;*P＜0.05 compared with the control group;#P＜0.05 compared with the STZ group

圖4 沙棘多糖對糖尿病大鼠腎功能及組織形態的影響A：沙棘多糖下調糖尿病大鼠腎肥大指數 B：沙棘多糖下調糖尿病大鼠PRO 水平 C：沙棘多糖下調糖尿病大鼠血漿BUN 水平 D：沙棘多糖下調糖尿病大鼠血清SCR 水平E：沙棘多糖降低糖尿病大鼠腎組織損傷 *P＜0.05，與對照組比較#P＜0.05，與STZ 組比較Fig.4 Effects of seabucthorn polysaccharide on renal function and histomorphology in diabetic ratsA: SP down regulated the kidney hypertrophy index of diabetic rats; B: SP down regulated the urine protein level in diabetic rats ; C: SP downregulated the blood urea nitrogen level in diabetic rats;D: SP down regulated the serum creatinine level in diabetic rats ;E:SP reduced the pathological changes of kidney in diabetic rats;*P＜0.05 compared with the control group;#P＜0.05 compared with the STZ group

圖5 沙棘多糖對PERK/ATF4/CHOP 通路活性的影響A：Western Blot 檢測顯示沙棘多糖下調糖尿病大鼠p-PERK/PERK 比值及ATF4、CHOP 蛋白表達 B：各組PERK/ATF4/CHOP 通路活性統計圖 *P＜0.05，與對照組比較,#P＜0.05，與STZ 組比較Fig.5 Effects of Seabucthorn Polysaccharide on PERK/ATF4/CHOP pathway activityA:Protein expressions of ATF4/CHOP and p-PERK/PERK ratio in diabetic rats were detected by Western blot; B: Statistical diagram of PERK/ATF4/CHOP pathway activity of each group;*P＜0.05 compared with the control group;#P＜0.05 compared with the STZ group

腎功能損傷是糖尿病常見并發癥。研究表明，在高血糖和高游離脂肪酸的刺激下細胞產生過量活性氧，造成腎組織氧化應激損傷和炎癥反應，引起腎組織形態改變，導致腎小球濾過率下降[7～9]。PRO、SCR、BUN 含量是評判腎小球濾過性的重要指標。Hu 等[10]發現，糖腎康顆粒可以有效降低糖尿病模型大鼠PRO、SCR、BUN 含量及腎肥大指數，表明糖腎康顆粒可有效改善模型大鼠腎小球濾過功能，緩解腎功能損傷。本研究結果顯示，沙棘多糖可降低糖尿病模型大鼠的腎肥大指數、PRO、SCR、BUN 含量，并且緩解模型大鼠腎組織形態的改變。這提示，沙棘多糖具有緩解糖尿病大鼠腎功能損傷的重要作用。

關于沙棘多糖調控制血脂、血糖機制的報道不多。有研究顯示，飽和脂肪酸可通過激活PERK/ATF4/CHOP 途徑損傷肝，誘導人L02 和HepG2 肝細胞株內質網應激和細胞凋亡[11]。而飽和脂肪酸過高是導致血膽固醇、TG、LDL-C 升高的主要原因。本研究結果顯示，沙棘多糖下調了PERK/ATF4/CHOP 通路各蛋白的表達量和PERK 蛋白磷酸化水平。根據相關報道推測，沙棘多糖可能通過下調PERK/ATF4/CHOP 通路活性而緩解糖尿病發展。

綜上所述，沙棘多糖可降低糖尿病大鼠血糖、血脂和胰島素抵抗水平，進而緩解糖尿病大鼠肝、腎功能的損傷，而沙棘多糖發揮作用的機制可能與其抑制PERK/ATF4/CHOP 通路活性有關。沙棘多糖調控血脂、血糖機制尚不清楚，我們后續研究將進一步探索。