基于檸檬酸合成的新型可降解螺釘生物相容性和生物力學特性的研究

楊誠，李禎，廖堅文，樊仕才，楊健，白曉春

1.南方醫科大學第三附屬醫院創傷骨科，廣東省骨科研究院，廣州 510630；2.武漢大學中南醫院麻醉科，武漢 430071；3.美國賓夕法尼亞大學材料與生物技術研究室，賓夕法尼亞州 16802；4.南方醫科大學基礎醫學院細胞生物教研室，廣州510515

目前臨床應用的金屬材料（不銹鋼、鈷合金、鈦合金等）具有需二次手術取出金屬內固定材料、應力遮擋作用及在體內釋放金屬離子等缺點[1～5]，而以聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚乙醇酸（polyglycolic，PGA）為代表的可降解吸收的高分子生物材料也存在自身的缺點：降解速度與新生骨生成速率不一致，降解產物多數呈酸性，長期在體內蓄積會導致局部PH值降低，進而造成遲發性無菌性炎癥、釘道周圍骨溶解等并發癥[6～8]。研究表明，作為三羧酸循環中間產物之一的檸檬酸（citric acid），在骨組織固有成分中占5%，且人體90%以上檸檬酸分子存在于骨中；天然骨磷灰石納米晶體表面的檸檬酸酯與磷灰石、膠原蛋白緊密結合，這些含檸檬酸的有機基質在調節磷灰石納米晶體的厚度，控制骨的強度及骨應力傳導中起重要作用[9～13]。受此啟發，本實驗室與美國賓夕法尼亞大學材料與生物技術研究室的楊健教授團隊協作，合成一系列基于檸檬酸的可降解骨生物仿生材料，并在動物與細胞模型中驗證了這些材料具有良好的骨融合與骨誘導性能[14～18]。本實驗利用前期合成的檸檬酸多聚體與納米羥基磷灰石復合高分子材料Poly（octanediol citrate）-click-Hydroxyl apatite（以下簡稱POC-Click-HA）制作全螺紋松質骨螺釘，用于比格犬股骨外髁骨折（AO 分型33B1 型）固定，同時使用同等規格的已應用于臨床的聚消旋乳酸高分子Poly（DLlactide）（以下簡稱PDLLA）全螺紋松質骨螺釘作為對照，研究其固定骨端骨折的可行性、評估其生物相容性及生物力學性，為進一步研發新型內固定材料提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年比格犬9 只，雌雄不限，體重8～11 kg，單籠喂養，由中山大學實驗動物中心（東校區）提供。實驗動物生產許可證：SCXK（粵）2011-0029；使用許可證：SYXK（粵）2011-0112。

1.1.2 實驗器材（1）可吸收POC-click-HA 松質骨螺釘。自行制備。電腦繪制螺釘草圖，將數據導入機械加工軟件，連接數控機床，經過車外圓、車外形、車螺紋、去毛剌等工序，獲得POC-click-HA 松質骨螺釘，直徑5.5 mm，全長55 mm，螺紋長50 mm，初始強度＞60 Mpa，其彈性模量與松質骨相當。包裝好以鈷60輻射滅菌備用[17]。（2）可吸收骨折內固定聚消旋乳酸（PDLLA）螺釘。成都迪康中科生物醫學材料有限公司生產，環氧乙烷滅菌消毒。規格同上。（3）螺釘配套器械：推進器、螺絲刀、測深尺、埋頭器、鉆頭、絲錐。

1.2 實驗方法

1.2.1 手術 腹腔注射3%戊巴比妥鈉（1 ml/kg）進行麻醉生效后，取側臥位將比格犬固定在手術操作臺上，備皮，常規消毒，鋪無菌手術孔巾。自右膝關節外側入路，作一縱形手術切口，逐層切開暴露至關節囊（保留髕韌帶），將髕骨向膝關節內側推移使其脫位，進一步暴露股骨內、外髁。使用微型電鋸自上向下鋸斷股骨外髁（注意保留前后交叉韌帶），造成比格犬股骨外髁骨折模型（AO 分型為33.B1 型）。巾鉗復位骨折后，以直徑4.5 mm 鉆頭自股骨外側向內側鉆孔，攻絲、測深后使用POC-click-HA 松質骨螺釘固定骨折，螺釘穿透對側皮質。生理鹽水和碘伏充分沖洗后，逐層關閉切口，無菌敷料包扎，腿部管形石膏固定。同法，造左側股骨外髁骨折模型，以同等規格PDLLA 螺釘固定骨折，見圖1。術后單籠喂養，術后第1～3 d 予肌肉注射青霉素鈉160 萬單位/次/日預防感染。

1.2.2 主要觀察指標（1）一般情況及標本大體觀察：觀察比格犬術后的精神狀態、行走步態、飲食及切口愈合情況（傷口有無開裂、感染、竇道形成等）。（2）術后4 周、8 周、12 周處死3 只動物切取標本，對大體標本進行觀察并進行骨折部位Lane-Sandhu 組織學評分。（3）生物力學測試：測試地點為南方醫科大學系統解剖學實驗室，生物力學測試機器為Bose Electroforce，將標本置于測試平板上，平板固定于機器底座。取直徑5 mm 的金屬棒垂直對準松質骨螺釘，使用計算機控制金屬棒從上往下移動，推頂螺釘，電腦同步測量并記錄推出螺釘的最大力量，即為界面應力最大載荷。

1.3 統計學方法

采用IBM SPSS Statistics 18.0 統計軟件分析處理。計量資料統計描述用均數±標準差（Mean±SD）表示。不同組間術后3 個時間點的比較采用析因方差分析法。P＜0.05 表明具有統計學差異。

2 結果

2.1 大體情況

2.1.1 動物一般情況 實驗動物均存活至實驗完成。術后精神、食量、活動量逐漸恢復，1 周后即可緩慢步行，4～6 周后行走步態基本正常；傷口均愈合良好，未見明顯紅腫、膿液滲出、竇道形成等術后并發癥。

2.1.2 標本觀察 術后按時間點取材，由標本可見兩組骨折均固定牢固，無明顯移位。兩組螺釘螺帽周圍均有纖維結締組織包裹，無充血、水腫及化膿等，關節面結締組織不多，較為平整。骨折愈合情況：4 周骨折線清晰可見，骨折縫隙內充滿白色纖維組織；8 周骨折稍模糊，骨折縫隙內仍有較多白色纖維組織；12周骨折線更為模糊，部分縫隙內有少量纖維組織，有的甚至完全吸收，符合骨折愈合標準。矢狀位截面可見，術后12 周與術后8 周相比，螺釘與周圍骨組織結合更為緊密，POC-click-HA 組部分有新生骨組織從螺釘表面向內部生長（圖2）。

2.2 Lane-Sandhu 組織學評分

圖1 比格犬股骨外髁骨折（AO 分型33.B1 型）手術圖片A：材料外觀 黃色為POC-click-HA 材料，無色透明為PDLLA 材料 B：常規備皮、消毒、鋪巾 C：逐層切開 D：暴露股骨外髁 E：暴露股骨外髁，骨折造模成功F：鉆孔與攻絲 G：POC-click-HA 螺釘固定（白色箭頭） H：PDLLA 螺釘固定（黃色箭頭）I：術后腿部管型石膏固定Fig.1 Surgical picture for Beagle lateral femoral epicondyle fracture (AO classification type B1)A: configuration of the materials(yellow indicated POC-click-HA,transparent indicated PDLLA);B: skin preparation,disinfection,draping; C: incision; D:exposure of the lateral femoral epicondyle; E: success of the fracture modeling; F: drilling and tapping; G: fixation of the POCclick-HA screws (white arrows);H: fixation of the PDLLA screws(yellow arrows); I: tubular gypsum fixation post-operation

圖2 骨折內固定術后標本整體外觀及矢狀位截面圖A、B：12 周PDLLA 螺釘正、側位觀C、D：12 周POC-click-HA 螺釘正、側位觀E、F：8 周、12 周POC-click-HA 螺釘矢狀位截面G、H：8 周、12 周PDLLA 螺釘矢狀位截面Fig.2 Integral appearance of the specimen 12 weeks after the internal fixation and sagittal section of the specimen 8 weeks and 12 weeks after the internal fixation.A and B indicated anteroposterior view and lateral view of the PDLLA at 12 weeks; C and D indicated anteroposterior view and lateral view of the POC-click-HA at 12 weeks; E and F indicated sagittal section of POC-click-HA screws at 8 weeks and 12 weeks; G and H indicated sagittal section of PDLLA screws at8 weeks and 12 weeks

術后3 個時間點對骨折部位進行Lane-Sandhu 組織學評分，結果顯示：組內各時間點評分差異有統計學意義（P＜0.05），說明隨著時間推移，兩組骨折被螺釘固定后均表現出良好的愈合。但在術后3 個時間點兩組螺釘分別進行對比，評分均無統計學差異（P＞0.05），說明POC-click-HA 螺釘與PDLLA 螺釘固定對骨折愈合效果無明顯差異（圖3）。

圖3 螺釘內固定術后各時間點骨折部位Lane-Sandhu組織學評分圖*P＜0.05，組內各時間點對比Fig.3 Lane-Sandhu histologic grading pictures at different time point after the internal fixation*P＜0.05,compared at each time points in the group

2.3 螺釘-骨界面應力載荷測試結果

使用生物力學測試機對兩組螺釘術后3 個時間點的螺釘-骨界面最大應力載荷進行測量。兩組螺釘各自組內對比：兩組均顯示組內術后3 個時間點的釘-骨界面最大應力載荷有差異，具有統計學意義（P＜0.05），說明隨著時間增長，螺釘與骨組織結合得更緊密。組間對比：將術后每個時間點測得的PDLLA 組與POC-click-HA 組螺釘-骨界面最大應力載荷進行對比，結果顯示4 周PDLLA 組載荷高于POC-click-HA組，具有統計學差異（P＜0.05）；8 周和12 周，兩組釘-骨界面載荷對比無統計學差異（P＞0.05），說明內固定初期POC-click-HA 螺釘固定強度不及PDLLA 螺釘，但到了后期二者固定強度無明顯差別（圖4）。

3 討論

3.1 POC-click-HA 骨螺釘的生物相容性

本組前期研究合成多孔隙的檸檬酸組織工程支架材料與骨髓間充質干細胞（BMSC）進行共培養，發現該POC-click-HA 材料支架為BMSC 細胞的粘附提供了良好的附著點，BMSC 細胞活性良好，能進一步生長和分化，證明此類聚檸檬酸復合生物材料的生物相容性和生物安全性[14～18]。在本實驗，POC-click-HA松質骨螺釘組比格犬切口未見紅腫、感染、縫線開裂，無竇道形成，術后12 周未見遲發性炎癥反應、釘道周圍骨溶解等并發癥，而且在后期可以看到螺釘和骨較好整合，說明POC-click-HA 骨螺釘材料在中長期內對周圍組織無明顯刺激，不引起異物排斥反應，無毒性。

圖4 骨螺釘內固定術后各時間點釘-骨界面最大應力載荷圖*P＜0.05，組內各時間點對比及4 周組間對比Fig.4 Maximum stress load picture of the screw-bone tissue interface after the internal fixation at different time point*P＜0.05,compared at each time points in the group and compared at 4 weeks between the two groups

3.2 POC-click-HA 骨螺釘的生物力學強度

生物力學強度測試得到的螺釘-骨界面應力實際上由兩種結合力量構成-機械結合力和生物結合力[19]。前者指螺釘與骨組織之間的把持和嵌合力，在內固定初期意義重大；后者指隨著時間推移，螺釘與骨組織整合的力量，在內固定后期發揮更重要的作用。POCclick-HA 螺釘的局限在于機械結合力稍弱，因此術后4 周測得的螺釘-骨界面最大應力載荷低于PDLLA 螺釘，推測原因有兩點：第一，PDLLA 螺釘植入骨組織后會產生自身徑向膨脹效應而更牢固地把持骨組織，POC-click-HA 螺釘不具有這種特性；第二，與POCclick-HA 螺釘螺紋的分布、深度、間距等設計有關，進一步改善螺釘有望獲得更好的把持力。而術后8 周、12 周測得的螺釘-骨界面最大應力載荷兩組螺釘接近，原因可能是POC-click-HA 螺釘具有很強的骨誘導能力和更好的降解性，使新生骨礦化并產生骨小梁，快速地與周圍骨組織發生整合，產生較強的生物結合力。因此能彌補機械結合力的不足，在術后8 周和12周表現出不遜于PDLLA 螺釘強度的界面應力載荷。

3.3 POC-click-HA 骨螺釘的優缺點

現用于臨床研究的生物可吸收材料主要有多聚乙醇酸（PGA）和多聚乳酸（PLA）。由于PGA 降解后產生酸性產物，降低周圍組織pH 值，引起骨溶解、異物反應、無菌性骨囊腫等不良事件，而且螺釘機械強度下降過快，臨床已很少使用；PLA 是目前臨床應用最廣泛的可吸收材料[20]。王毅等[21]采用PDLLA 可吸收舟骨螺釘在標本內的抗彎曲、抗拉伸強度及固定骨折的實際效果觀察，認為該螺釘對手舟骨腰部骨折的固定效果較克氏針更理想，是一種可行的手舟骨骨折固定材料。秦金橋等[22]研究認為PDLLA 混合殼聚糖可吸收髓內釘在多指再植指骨固定方面較克氏針有明顯的優勢。還有研究表明PLA 螺釘在踝關節骨折、下脛腓骨聯合損傷中應用取得良好臨床效果[23,24]。但PLA 降解時間長，不利于促進骨生長的細胞粘附限制了它的應用[20]。而POC-click-HA 材料最大優點是具有和骨組織相同成分的檸檬酸，還具有誘導成骨的作用[14～18]，因此它的組織相容性更好，從圖2 可見POC-click-HA 螺釘與骨組織整合更強，術后12 周已部分降解融合，這也是術后8 周和12 周兩組釘-骨界面載荷對比無顯著差異的原因（圖3）。但POC-click-HA 螺釘的缺點是初始生物力學強度較PDLLA 螺釘弱，對骨折早期固定缺乏加壓作用，表現為4 周時POC-click-HA 釘的載荷低于PDLLA 組（圖4）。

總而言之，POC-click-HA 螺釘在本實驗過程中表現出良好的生物相容性，且具有一定力學強度，對于比格犬股骨外髁B1 型骨折具有較好的內固定作用。本組下一步的工作是通過影像學和組織學進一步評估POC-click-HA 螺釘在體內的降解性及誘導成骨性，并探討其作用機制，進而優化材料的組成和結構，增強力學強度，使其能成為一種新型的可吸收骨折內固定材料。