E003對RSA 模型小鼠蛻膜組織超微結構的影響

龍生根，章志琴，黃志輝，夏雷震，唐亮，伍瓊芳，黃歐平

江西省婦幼保健院 1.婦科腫瘤，2.輔助生殖中心，3.婦科，南昌 330006

反復自然流產（recurrent spontaneous abortion，RSA）又稱習慣性流產，是指連續發生兩次及以上的妊娠20 周以內妊娠損失，發病率為1%～5%，60%以上原因不明，稱為不明原因復發性流產（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA），RSA 是全世界共同關注的疑難雜癥[1～3]。E003 即瑞香素（daphnetin）作為我國首創的天然藥物，其藥理作用十分廣泛，主要包括：抗炎、抗氧化、抗病原微生物、抗腫瘤、免疫調節等[4～8]，但其在流產方面的作用尚未見任何報道。本研究通過觀察RSA 模型小鼠蛻膜組織形態和超微結構，首次探討瑞香素對RSA 模型小鼠的可能治療作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

將雌性CBA/J 與雄性BALB/c 小鼠按2：1 合籠交配建立正常妊娠小鼠模型，雌性CBA/J 小鼠與雄性DBA/2 小鼠按2：1 比例合籠交配建立RSA 小鼠模型，檢出陰栓者計為妊娠第0 d。實驗共分4 組：正常妊娠組、RSA 模型組、E003 低劑量組（1 mg·kg-1·day-1）、E003 高劑量組（4 mg·kg-1·day-1），每組10 只雌鼠。

1.2 實驗方法

1.2.1 RSA 模型小鼠制備及大體胚胎觀察 各組從妊娠第0 d 開始灌胃給藥，E003 高劑量組和低劑量組灌胃容積均為0.4 ml/20 g[9]，正常妊娠組和RSA 模型組給予相同體積蒸餾水，連續給藥14 d，末次給藥1 h后處死小鼠，打開腹腔，暴露子宮，觀察子宮生長情況，記錄胚胎著床數目和胚胎吸收數目并取其蛻膜組織。

1.2.2 蘇木精-伊紅（HE）染色 分離蛻膜組織，4%多聚甲醛溶液內固定24 h，水洗，固定，脫色，包埋，切片，經HE 染色后BX51 熒光顯微鏡觀察。

1.2.3 透射電鏡標本制備 新鮮組織確定取材部位，組織體積≤1 mm×1 mm×1 mm，迅速投入電鏡固定液4 ℃固定2～4 h。0.1 mol/L 磷酸緩沖液PB（pH 7.4）漂洗3 次，每次15 min；1%的鋨酸0.1 mol/L 磷酸緩沖液PB(pH 7.4)室溫（20 ℃）固定2 h。0.1 mol/L 磷酸緩沖液PB(pH 7.4)漂洗3 次，每次15 min；組織依次入50%-70%-80%-90%-95%-100%-100%酒精-100%丙酮-100%丙酮上行脫水，每次15 min；丙酮：812 包埋劑=1：1 2～4 h，丙酮：812 包埋劑=2：1 滲透過夜，純812 包埋劑5～8 h，將純812 包埋劑倒入包埋板，樣品插入包埋板后37 ℃烤箱過夜；60 ℃烤箱聚合48 h；超薄切片機切取60～80 nm 超薄切片；鈾鉛雙染色（2%醋酸鈾飽和酒精溶液，枸櫞酸鉛，各染色15 min），切片室溫干燥過夜；HT7700 透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

2 結果

2.1 小鼠子宮胚胎形態

正常妊娠組小鼠子宮胚胎形狀似串珠，色澤光鮮，大小均一；RSA 模型組子宮呈黑紫或褐色，內可見陳舊性出血或伴血凝塊，體積變小，部分胚胎萎縮或消失；E003 處理組（低劑量組和高劑量組）胚胎吸收率低于RSA 模型組，差異具有統計學意義，P＜0.05；E003 高劑量組胚胎吸收率與正常妊娠組相比無統計學差異，P＞0.05（表1，圖1）。

表1 各組小鼠胚胎吸收率（%，n=10）Tab.1 Comparison of embryo absorption rate in each group(%，n=10)

2.2 小鼠子宮蛻膜組織形態學

正常妊娠組可見蛻膜細胞排列整齊，間隙緊密，大小均勻，數量正常；RSA 模型組蛻膜細胞碎裂，數量明顯減少；E003 低劑量組蛻膜細胞數量較模型組增多，排列較整齊；E003 高劑量組蛻膜細胞數量較模型組增多，排列更整齊（圖2）。

2.3 小鼠蛻膜組織超微結構

正常妊娠組可見體積較大的蛻膜細胞，細胞排列整齊，間隙緊密，細胞核大而圓、核內以常染色質為主，細胞漿內含豐富的細胞器；RSA 模型組蛻膜細胞體積減小，細胞間隙明顯增大，細胞核曲度增加，異染色質增多且靠近核膜，胞漿致密，可見粗面內質網和少量空泡樣變的線粒體；E003 低劑量組相較模型組，蛻膜細胞體積增大，細胞間隙變小；E003 高劑量組相較模型組，蛻膜細胞體積增大，細胞間隙更小（圖3）。

2.4 小鼠蛻膜組織血管內皮超微結構

圖1 各組小鼠胚胎形態A：正常妊娠組, 胚胎形似串珠，大小均一，色澤光鮮 B：RSA 模型組,呈褐色，內可見陳舊性出血或血凝塊，體積變小，部分胚胎萎縮、消失 C：E003 低劑量組,胚胎吸收率低于RSA 模型組 D：E003 高劑量組,形態接近正常妊娠組Fig.1 Embryos morphology of each groupA: normal pregnancy group,the embryos were beaded,uniform in size and bright in color; B: RSA model group,the embryos were brown with old bleeding or blood clots,it was small in volume,and some embryos atrophied and disappeared; C:E003 low-dose group,embryo absorption rate was lower than that of the RAS model group; D:E003 high-dose group,morphology was close to the normal pregnancy group

圖2 各組小鼠子宮蛻膜細胞組織形態A：正常妊娠組, 細胞排列整齊，間隙緊密，大小均勻，數量正常 B：RSA 模型組,細胞碎裂，數量明顯減少 C：E003 低劑量組,細胞數量較模型組增多，排列較整齊 D：E003 高劑量組,細胞數量較模型組增多，排列更整齊Fig.2 Morphology of the uterus decidual tissues of mice in each groupA: normal pregnancy group,the cells were in alignment,the space was close,the size was uniform and the number was normal; B: RSA model group,the cells were broken up and the number significantly reduced; C:E003 low-dose group,the cells number was larger than that of the model group and the cells were in alignment; D:E003 high-dose group,the cells number was larger than that of the model group and the cells were more neatly arranged

圖3 各組小鼠蛻膜組織超微結構A：正常妊娠組,蛻膜細胞排列整齊，間隙緊密 B：RSA 模型組,細胞體積減小，細胞間隙明顯增大，少量空泡樣變的線粒體 C：E003 低劑量組,相較模型組細胞體積增大，細胞間隙變小 D：E003 高劑量組,相較模型組細胞體積增大，細胞間隙更小箭頭指向蛻膜細胞Fig.3 Ultrastructure of decidual tissues of mice in each groupA: normal pregnancy group,the decidual cells were neatly arranged and closely spaced; B: RSA model group,the volume of decidual cells decreased,the intercellular space significantly increased,and a small number of vacuol-like mitochondria were observed; C:E003 low-dose group,the volume of decidual cells was larger than that in the model group,and the intercellular space was smaller than that in the model group; D:E003 high-dose group,the volume of decidual cells was larger than that in the model group,and the intercellular space was smaller than that in the model groupArrows were indicated by decidual cells

正常妊娠組血管壁完整，由單個或多個血管內皮細胞環繞而成，血管內皮細胞結構完整，細胞膜向腔面突起，核膜完整。RSA 模型組血管壁不完整，血管內皮細胞結構不完整，細胞核呈梭形。相較模型組，E003 低劑量組血管壁較完整，血管內皮細胞呈長梭形，血管內皮細胞結構較完整，細胞間隙稍增寬；E003 高劑量組血管壁更完整，由單個或多個血管內皮細胞環繞而成，血管內皮細胞結構更完整，細胞膜向腔面突起，核膜較完整（圖4）。

3 討論

圖4 各組小鼠蛻膜組織血管內皮超微結構A：正常妊娠組,血管壁完整，由單個或多個血管內皮細胞環繞而成，血管內皮細胞結構完整 B：RSA 模型組,血管壁不完整，血管內皮細胞結構不完整，細胞核呈梭形 C：E003 低劑量組,血管壁較模型組完整，血管內皮細胞呈長梭形 D：E003 高劑量組,血管壁接近正常妊娠組箭頭指向血管內皮細胞Fig.4 Ultrastructure of vascular endothelial cells in decidual tissues of mice in each groupA: normal pregnancy group,the vascular wall was intact,and surrounded by a single or multiple vascular endothelial cells.The vascular endothelial cells were intact in structure; B:RSA model group,the vascular wall was incomplete,the vascular endothelial cell structure was incomplete,and the nucleus was fusiform; C:E003 low-dose group,the vascular wall was more complete than that of the model group,and the vascular endothelial cells were long fusiform;D:E003 high-dose group,the vascular wall was close to the normal pregnancy group

RSA 不僅對患者的健康和心理狀況產生重大影響，甚至可能引發一系列家庭問題，因此RSA也被認為是一個影響婚姻關系的生活事件，或給社會帶來不穩定因素；并與胃病或特應性皮炎的風險增加有關[10～12]，所以尋找一種有效防止流產的方法，提高治療策略和診斷至關重要，具有積極的臨床和社會意義。

瑞香素化學名7，8-二羥基香豆素（7，8-dihydmxycoumarin），又名祖師麻甲素，是香豆素類化合物的代表性單體成分，為典型的香豆素衍生物，來源廣泛，藥用價值大。雖然其部分藥理作用目前僅限于動物實驗或細胞層面研究，但也為深入探明瑞香素的潛在藥理活性奠定了堅實基礎。

子宮內膜是胚胎種植、從中吸取營養并得以繼續生長發育的重要組織，其正常發育、對胚胎的良好接受性以及與胚胎之間的相互協調，對于成功妊娠具有重要意義。蛻膜基質細胞（DSCs）是人蛻膜的主要細胞成分，在胚胎著床、維持妊娠、母胎免疫耐受過程中發揮重要作用[13,14]。在卵巢激素的作用下，這些DSC前體離開血管，分化為蛻膜細胞，并在黃體后期（蛻膜期）擴散至基質。易流產的雌性CBA/J 小鼠與雄性DBA/2 小鼠交配是由免疫介導的自然流產動物模型，其母體和胎兒的免疫耐受已經破壞[15]。董立軍等[16]發現RSA 患者蛻膜細胞失去細胞間連接及發生細胞解體、嗜酸性增強等變化，從而使胚胎發育的正常環境被破壞，導致流產的發生。楊美霞等[17]同樣發現RSA 患者蛻膜細胞有明顯壞死，細胞連接消失，血管內皮受損，嚴重破壞了胚胎發育所需內環境，從而導致流產的發生。

本實驗首次通過瑞香素灌胃制作RSA 模型小鼠，解剖小鼠子宮計算胚胎吸收率結果顯示E003 處理組（低劑量組和高劑量組）胚胎吸收率低于RSA 模型組，差異具有統計學意義，P＜0.05；E003 高劑量組胚胎吸收率與正常妊娠組相比無統計學差異，P＞0.05。同時光鏡下可見RSA 模型組蛻膜細胞碎裂，數量較正常妊娠組明顯減少；E003 低劑量組和高劑量組均較模型組蛻膜細胞數量增多，排列較整齊。電鏡下RSA 模型組較正常妊娠組蛻膜細胞體積減小，細胞間隙明顯增大，細胞核曲度增加，異染色質增多且靠近核膜，胞漿致密，可見粗面內質網和少量空泡樣變的線粒體，血管壁不完整，血管內皮細胞結構不完整，細胞核呈梭形；E003 低劑量組較模型組蛻膜細胞體積增大，細胞間隙增大，血管壁較完整，血管內皮細胞呈長梭形，血管內皮細胞結構較完整，細胞間隙稍增寬；E003 高劑量組較模型組蛻膜細胞體積增大，細胞間隙增大，血管壁較完整，由單個或多個血管內皮細胞環繞而成，血管內皮細胞結構較完整，細胞膜向腔面突起，核膜較完整。

綜上所述，本研究認為瑞香素可能通過作用于RSA 模型小鼠蛻膜細胞和子宮內膜血管形成，從而對RSA 達到一定的治療作用。但其具體機制需繼續研究。相信瑞香素作為我國自主創新的藥物，隨著生物技術的發展和學者的不斷探尋，其多種藥理機制也會進一步闡明，拓展其應用，發揮我國傳統醫學的優勢。