miR-206靶向Cx43調控ERK1/2通路在兔激素性股骨頭壞死中的作用

席源，羅高斌，魏桂清，覃文濤，薄占東

1.廣西醫科大學第一附屬醫院骨關節外科，南寧 530021；2.中國人民解放軍南部戰區總醫院骨科醫院，廣州 510010

股骨頭壞死是臨床常見的難治性疾病，后期可導致股骨頭塌陷并繼發嚴重的功能障礙，致殘率極高，多數患者最終需選擇關節置換等外科治療。近年來由于激素的廣泛運用，糖皮質激素已成為非創傷性股骨頭壞死的重要致病因素[1,2]，且口服皮質類固醇對股骨頭缺血性壞死的病理發展有持續性影響[3]。但其確切機制尚不明確，多種治療方法的療效不盡人意。探索激素性股骨頭壞死（steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）發病機理，對SANFH 的診治有重要意義。本組前期研究證實，SANFH 患者股骨頭內微小RNA（MicroRNA，miR）-206 表達上調，同時縫隙連接蛋白（connexin，Cx）43 表達下調，提示Cx43/miR-206 參與SANFH 的發生發展[4]。據載，Cx43高表達可激活細胞外信號調節蛋白激酶（ERK）1/2 信號通路，進而促進成骨分化[5]。本研究檢測兔SANFH 模型中miR-206、Cx43、ERK1/2 及Runx2表達變化，探討Cx43/miRNA-206 及其下游ERK1/2 通路在SANFH 中的作用，初步闡明其機制，期為SANFH 診治提供新的理論支持。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康新西蘭大白兔（廣西醫科大學實驗動物中心提供并代為飼養，實驗動物使用許可證號：SYXK 桂2014-0003），質量（2.5±0.3）kg。

1.1.2 主要試劑及儀器 注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（輝瑞制藥，比利時），大腸桿菌內毒素（sigma，美國）；miRNA 原位雜交試劑盒（EXIQON，丹麥）；鼠抗-Cx43（Santa，美國）、兔抗-ERK1/2、兔抗-P-ERK1/2、鼠抗-βtubulin（CST，美國），鼠抗-Runx2（Abnova，中國臺灣）；IRDye 800CW goat anti-mouse IgG（H+L）、IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG（H+L）二抗（Licor，美國）；磷酸酶抑制劑PhosSTOP（Roche，瑞士），RIPA 裂解液（強）、Bradford 蛋白濃度測定試劑盒（生工生物，中國），免疫組織化學試劑盒（博士德，中國）；總RNA 小量制備試劑盒（Corning，美國）、PrimeScript ?RT reagent Kit 和TB Green?Premix Ex Taq?II（Takara，日本）。TDH-500 原位雜交儀（奧盛，中國），Mini-PROTEAN3 電泳槽和Mini Trans-Blot 轉印槽（Bio-Rad，美國），ABI 7500 Fast 熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems，美國）；Gyroscan T5-NT 磁共振成像儀（Philips，荷蘭）。

1.2 方法

1.2.1 激素性股骨頭壞死模型構建與分組 成年新西蘭大白兔60 只，均分為實驗組和對照組；替補實驗動物數只。實驗組兔耳緣靜脈注射內毒素（10 mg/kg），24 h 后重復1 次，隨即臀肌注射甲強龍（20 mg/kg），共4 次，每次間隔24 h；注射內毒素前1 d 肌注青霉素鈉（8×104U）+蘭索拉唑（10 mg），1 次/d，共7 次。對照組兔注射等量生理鹽水。注射后第2 周、8 周和16 周，行核磁共振（MRI）檢查。檢查后隨機取實驗組和對照組各10 只動物予以空氣栓塞處死，取出雙側股骨頭，按冠狀面切為薄片，PBS 溶液沖洗，一半置于4%多聚甲醛溶液固定，10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液脫鈣，梯度酒精脫水，石蠟包埋，5 mm 切片，HE 染色，應用Image-Pro-Plus 軟件計數空骨陷窩，計算各組空骨陷窩率。T1 加權像表現為點狀、細線狀、片狀低信號或T2 加權像表現為點狀、細線狀、片狀高信號；骨小梁排列紊亂、變細或斷裂，骨小梁內出現彌漫性空骨陷窩或核皺縮，伴周圍骨髓細胞壞死診斷為股骨頭壞死。

1.2.2 免疫組織化學檢測 按上述方法制備組織切片，60 ℃烘烤30 min，常規脫蠟至水，10%H2O2溶液處理以滅活內源性酶，0.01 mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）高壓修復抗原，滴加5% BSA 室溫封閉20 min。滴加羊抗-Cx43 一抗4 ℃過夜，PBS（pH 7.2～7.6）洗2 min×3 次，滴加聚合HRP 標記抗羊IgG，37 ℃孵育30 min，DAB 顯色，鏡檢。每張切片選取3 個高倍視野，應用Image-Pro-plus 軟件測量積分光密度值（IOD），并行統計學分析。

1.2.3 miRNA-206 原位雜交 組織切片脫蠟、水化，滴加蛋白酶K 孵育10 min，PBS 洗2 次，梯度酒精脫水；滴加25 ml 雜交混合液于50～60 ℃雜交1 h，1%山羊血清封閉15 min，再加入DIG-AP 抗體（10：800）室溫孵育1 h；PBST 洗3 次，加入AP 底物，30 ℃避光孵育2 h，水洗2 次；細胞核染液復染，鏡下觀察。

1.2.4 熒光定量PCR 檢測（1）按試劑盒說明書提取樣本總RNA。瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA 質量，紫外分光光度計計算RNA 濃度。（2）按PrimeScript?RT reagent Kit 說明書進行逆轉錄。（3）實時熒光定量：對逆轉錄產物進行qPCR 擴增。通過計算2-△△Ct值統計各組目的基因表達的差異。各基因引物見表1。1.2.5 Western blot 檢測 用RIPA+PMSF+磷酸酶抑制劑（體積比100：1：1）提取總蛋白。蛋白定量后，取30 mg 蛋白質行SDS-PAGE 凝膠電泳。電泳后轉至NC 膜，5%BSA 室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜（工作濃度Cx43 為1：5000，ERK1/2 為1：1000，P-ERK1/2為1：2000，Runx2 為1：2000，β-Tubulin 為1：10000）。二抗室溫孵育1 h（工作濃度為1：10000），Odyssey 成像系統拍照，IPP 軟件測定條帶灰度值，采用目的條帶與β-Tubulin 條帶的灰度比值表示目的蛋白相對表達水平（其中P-ERK1/2 條帶與ERK1/2 條帶相對比）。

表1 熒光定量PCR 引物序列Tab.1 qPCR-specific primer sequence

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 激素性股骨頭壞死模型制作結果

在建模過程中，2 周和8 周實驗組兔分別死亡3只和2 只，16 周無死亡，死亡兔予以補足。對照組無死亡。MRI 檢查：對照組兔股骨頭為正常信號影；實驗組兔股骨頭T1 加權像顯示股骨頭斑塊狀中度信號影，T2 加權像表現為不均勻高信號影，伴隨關節積液（圖1）。HE 染色：對照組骨小梁完整，空骨陷窩少見（圖2A）；實驗組骨小梁變細、斷裂，骨小梁內空骨陷窩增多，髓腔組織中脂肪細胞直徑增大（圖2B～D）。股骨頭內空骨陷窩率（%）：2 周實驗組（13.91±2.20）、8周實驗組（16.98±1.73）和16 周實驗組（20.74±1.92）明顯高于同期對照組（7.83±1.25）、（8.71±1.63）和（8.98±1.72），差異均有統計學意義（t=7.599，P=0.000；t=11.002，P=0.000；t=14.427，P=0.000）。

圖1 股骨頭MRI 檢查結果A：實驗組T1 加權像 B：實驗組T2 加權像 C：對照組T1 加權像 D：對照組T2 加權像藍色箭頭指斑塊狀信號影 紅色箭頭指關節積液Fig.1 MRI imaging of bilateral femoral headsA：T1WI coronal scan of rabbits in the model group; B：T2WI coronal scan of rabbits in the model group; C：T1WI coronal scan of rabbits in the control group; D：T2WI coronal scan of rabbits in the control groupBlue arrow:plaque signal shadow;Red arrow:joint effusion

經MRI 檢查和HE 染色篩選，2 周和8 周實驗組分別有3 只和1 只動物股骨頭未出現典型壞死而被剔除。模型成功率為70%。

2.2 免疫組織化學染色檢測Cx43 表達

免疫組織化學染色陽性為棕黃色，正常情況下Cx43 陽性表達于成骨細胞、骨細胞及髓腔中。檢測發現，對照組股骨頭強陽性表達Cx43，2 周、8 周和16周實驗組較對照組染色明顯減弱。IOD 結果顯示：2周實驗組IOD（39.43±4.47）較2 周對照組（59.23±7.90）降低，差異有統計學意義（t=6.898，P=0.000）；8 周實驗組IOD（32.34±4.52）較8 周對照組（61.53±5.65）明顯降低，差異有統計學意義（t=12.757，P=0.000）；16 周實驗組IOD（27.14±6.50）較16周對照組（60.77±6.36）明顯降低，差異有統計學意義（t=11.694，P=0.000），見圖3。

2.3 原位雜交檢測結果

原位雜交檢測，紫藍色為陽性MiR-206，核為粉紅色。實驗組miR-206 強陽性表達于髓腔、成骨細胞和少量骨細胞內，對照組miR-206 僅少量表達于髓腔和成骨細胞內（圖4）。

2.4 qPCR 檢測結果

圖2 股骨頭組織病理檢查結果（HE 染色）A：對照組 B：2 周實驗組 C：8 周實驗組 D：16 周實驗組藍色箭頭指脂肪細胞 黑色箭頭指空骨陷窩 紅色箭頭指斷裂的骨小梁Fig.2 HE staining of the femoral heads in the two groupsA: control group; B：model group of 2 weeks; C：model group of 8 weeks; D：model group of 16 weeks； Blue arrow: fat cells；Black arrow:empty lacuna； Red arrow:fractured trabecular bone

圖3 免疫組織化學染色檢測Cx43A：對照組股骨頭Cx43 強陽性表達于骨小梁邊緣成骨細胞，骨細胞和髓腔內 B：2 周實驗組股骨頭Cx43 陽性表達于成骨細胞和髓腔內 C：8 周實驗組股骨頭內Cx43 弱陽性表達于成骨細胞和髓腔內 D：16 周實驗組股骨頭內Cx43 弱陽性表達于成骨細胞和髓腔內 E：Cx43 免疫組織化學染色IOD 比較*與同期對照組比較，P＜0.01Fig.3 Cx43 ISH stainingA:Cx43 of the femoral head of the control group was positively expressed on the trabecular bone marginal osteoblasts,osteocytes and intramedullary cavity;B: Cx43 of the 2 weeks model group was positively expressed on osteoblasts and intramedullary cavity; C: Cx43 of the 8 weeks model group was weak expressed on osteoblasts and intramedullary cavity; D:Cx43 of the 16 weeks model group was weak expressed on osteoblasts and intramedullary cavity; E:IOD comparison of Cx43 ISH staining;*Compared with the control group at corresponding time points,P ＜0.01

圖4 原位雜交檢測miR-206對照組（A）股骨頭內僅少量miR-206 表達于髓腔和成骨細胞內，2周（B）、8 周（C）和16 周（D）實驗組股骨頭內見大量miR-206 表達于成骨細胞、骨細胞及髓腔Fig.4 ISH of miR-206A: Only a small amount of miR-206 expression was in the medullary cavity and osteoblasts in the femoral head of the control group; B,C and D:A large amount of miR-206 expression was in osteoblasts,osteocytes and medullary cavity in the femoral head of model group at 2、8 and 16 weeks

圖5 qPCR 檢測2 周、8 周、16 周實驗組和對照組miR-206（A）、Cx43（B）和Runx2（C）相對表達量統計圖*與對照組比較，P＜0.05Fig.5 qPCR of miR-206(A)、Cx43(B)and Runx2(C)in model group and control group at different times*Compared with the control group,P＜0.05

qPCR 檢測顯示，miR-206 在實驗組股骨頭內表達較對照組上調，造模后第2 周、8 周和16 周，實驗組股骨頭內miR-206 表達量與對照組股骨頭內miR-206 表達量的比值即2-△△ct為（2.85±0.09）、（2.91±0.11）和（3.28±0.12），差異有統計學意義（t=45.961，P=0.000；t=38.825，P=0.000 和t=42.484，P=0.000）；Cx43、Runx2 mRNA 在實驗組股骨頭內表達較對照組均減少，造模后第2 周、8 周和16 周，實驗組股骨頭內Cx43 表達量與對照組股骨頭內Cx43 表達量的比值即2-△△ct為（0.40±0.06）、（0.33±0.04）和（0.24±0.04），差異有統計學意義（t=-18.424，P=0.000；t=-37.442，P=0.000 和t=-42.472，P=0.000）；實驗組股骨頭內Runx2 表達量與對照組股骨頭內Runx2 表達量的比值即2-△△ct為(0.82±0.09)、(0.69±0.04)和(0.51±0.05)，差異有統計學意義(t=-4.472，P=0.002；t=-17.324，P=0.000和t=-21.909，P=0.000)，見圖5。

2.5 Western blot 檢測

造模后2 周、8 周和16 周，Western blot 分析顯示，實驗組股骨頭內Cx43、Runx2 蛋白相對表達量均低于對照組股骨頭，組間差異有統計學意義（P＜0.05）；造模后2 周實驗組股骨頭內磷酸化ERK1/2 表達量與對照組無統計學差異（P＞0.05），造模后8 周和16 周，實驗組股骨頭內磷酸化ERK1/2 相對表達量均低于對照組，組間差異有統計學意義（P＜0.05）（圖6）。

3 討論

3.1 成骨分化與SANFH

圖6 免疫印跡檢測2 周、8 周、16 周實驗組和對照組Cx43、ERK1/2 和Runx2 相對表達量（A）及其統計圖（B）*與對照組比較，P＜0.05Fig.6 Immuno blotting results A:Western blot of Cx43,ERK1/2 and Runx2 in model group and control group at 2,8,16 weeks；B：Relative expression of Cx43,ERK1/2 and Runx2 in model group and control group at 2,8,16 weeks*Compared with the control group,P ＜0.05

骨的發育塑形由成骨細胞、骨細胞和破骨細胞協同完成，成骨細胞參與骨基質的合成、分泌及礦化等，在骨發育成熟和修復重建過程中起重要作用。研究發現，SANFH 模型中成骨細胞分化能力顯著下降，成骨細胞數量減少及功能降低引起成骨分化不足，引發早期股骨頭壞死修復障礙[6]。激素可上調成脂相關基因（如PPAR-γ），同時下調成骨相關基因（如Runx2/Cbfa1），導致間充質干細胞成脂分化增加而成骨分化減少，成骨細胞生成減少[7,8]。自體成骨細胞移植可有效改善股骨頭壞死后的修復[9]。Runx2 屬于runt 結構域基因家族，能夠激活并啟動MSCs 向成骨細胞系分化。應用地塞米松誘導大鼠SANFH 模型研究發現，模型鼠股骨頭內Runx2 和osterix 基因表達、蛋白合成均較對照組減少[10]。本實驗應用內毒素聯合激素誘導兔SANFH 模型發現，實驗組兔股骨頭內Runx2 基因及蛋白表達均低于對照組，且隨時間推移有下降趨勢。以上結果表明，成骨分化在早期SANFH 中發揮重要作用，激素可能通過抑制成骨分化影響正常骨代謝，參與SANFH 的發生發展及修復過程。

3.2 miR-206 及其靶蛋白Cx43 在SANFH 中的作用

MicroRNA 是動植物中廣泛存在的一類分編碼單鏈小分子RNA，在調節正常細胞增殖、分化及凋亡方面發揮重要作用，與骨的正常發育、塑形和維持密切相關[11]。早期研究認為miR-206 特異性表達于骨骼肌[12]，而Inose 等[13]、Zhang 等[14]發現成骨細胞同樣表達miR-206。在C2C12 細胞成骨分化過程中，miR-206 下調，而過表達miR-206 則可抑制成骨細胞分化。在人骨髓間充質干細胞成骨誘導的第7 d 和第14 d，miR-206表達顯著下調，miR-206 過度表達的BMSCs 堿性磷酸酶（ALP）活性減弱，成骨標志物Runx2 和骨橋蛋白（OPN）的mRNA 水平顯著下調[15]。進一步研究表明，骨組織中一個重要的縫隙連接蛋白Cx43 是miR-206的靶蛋白，Anderson 等[16]研究表明，Cx43 基因的3，非翻譯區有兩個可以與miRNA-206 完全互補的序列，從而抑制Cx43 mRNA 的翻譯，減少Cx43 表達，以減少正在生成的肌纖維間的通訊，進而促進肌肉細胞分化。Inose 等[13]研究顯示在成骨細胞轉染miR-206 后，Cx43 蛋白表達減少，成骨細胞分化能力減弱，而轉染anti-miR-206 后，Cx43 蛋白的表達增加，促進成骨細胞分化。

Cx43 可通過調控骨細胞和成骨細胞功能參與骨的發生與塑形。在MC3T3-E1 成骨細胞中，過表達Cx43 會加強Runx2 的依賴性轉錄活性；反之，以siRNA 干擾Cx43 表達，Runx2 則受到抑制[17]。骨髓基質細胞成骨分化過程中Cx43 表達明顯增加，慢病毒介導的Cx43 表達下調后，成骨分化被抑制[18]。本研究顯示，miR-206 表達定位于股骨頭骨小梁周邊的骨細胞、成骨細胞及髓腔內，且實驗組股骨頭內表達較對照組增多；Cx43 及其mRNA 在實驗組股骨頭內表達均低于正常組。推測miR-206 可能通過下調Cx43導致了SANFH 的進展。值得一提的是，本研究觀察到實驗組股骨頭Cx43 mRNA 水平也降低，此結果和Inonse 等[13]研究結論有所出入，推測可能存在其他miRNA 或信號通路在SANFH 病程中對Cx43 基因轉錄具有調節作用，這需進一步研究。

3.3 ERK1/2 信號通路在SANFH 中的作用

本研究結果顯示，各時期實驗組兔股骨頭內ERK1/2 蛋白磷酸化水平均低于對照組，說明ERK1/2信號通路在SANFH 中被抑制。ERK1/2 通路是絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）系統中最為重要的通路之一，MAPKs 是細胞內執行信號級聯放大的一種蛋白，可將信號從細胞表面傳導至細胞核的重要介質，參與細胞生長發育、分裂活化和凋亡等多個生理過程。而ERK1/2 通路與成骨細胞增殖和分化密切相關[19,20]。細胞外信號如生長因子，與細胞膜上相應受體結合促進ERK 磷酸化，促進成骨轉錄因子Runx2 和osterix 表達，進而促進成骨細胞的分化和增殖[21]。Cx43 半通道開放可借助激活ERK1/2 信號通路，抑制促凋亡蛋白Bad，激活CAAT/增強子結合蛋白β（C/EBP β）的抗凋亡作用，從而抑制細胞凋亡，促進成骨細胞和骨細胞存活[22]。Cx43 高表達還可激活ERK1/2 信號通路，促進成骨相關轉錄因子Runx2 表達[4]。本研究發現實驗組兔股骨頭內Cx43、Runx2 基因表達下調，Cx43、ERK1/2、Runx2 蛋白表達也下調，表明SANFH 兔模型Cx43 下調，抑制了ERK1/2 信號通路，導致成骨分化障礙和骨細胞凋亡增加，參與SANFH 的發生發展。

據此推測，miR-206 可通過調低Cx43 水平，導致骨細胞間通訊“故障”，進而成骨障礙，最終引發SANFH；更進一步，Cx43 低表達可影響其下游ERK1/2 通路，引起成骨細胞分化障礙，參與SANFH 的發展過程。miR-206 和其目的蛋白Cx43、ERK1/2 或許是SANFH 診療新的切入點，miR-206 抑制劑可能對SANFH 的防治有正面效果。