2型糖尿病腎病實驗室診斷標(biāo)志物的研究進展

楊雪嬌，劉子杰

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，云南 昆明 650032；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，云南 昆明 650032)

糖尿病已成為全球性公共衛(wèi)生問題，根據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會2013年的數(shù)據(jù)，全球糖尿病患病人數(shù)為3.82億，25年內(nèi)將上升到5.92億，其中約90%是2型糖尿病[1]。我國是糖尿病的第一大國，成年人中糖尿病的發(fā)病率為11.6%[2-3]。糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥是糖尿病腎病，也是終末期腎病(ESRD)的主要病因，致死率較高[4]，早期診斷將有機會延緩甚至逆轉(zhuǎn)病情，因此發(fā)現(xiàn)早期診斷標(biāo)志物顯得尤為重要。本文主要闡述目前2型糖尿病腎病實驗室診斷指標(biāo)的局限性及蛋白質(zhì)類尿液生物標(biāo)志物的研究進展，以期為深入了解與開發(fā)可靠的生物標(biāo)志物提供新的思路與方向。

1 目前公認(rèn)的診斷標(biāo)志物

1.1白蛋白尿：白蛋白尿是早期糖尿病腎病的主要診斷指標(biāo)，也是疾病治療效果的判斷指標(biāo)，在早期GFR正常時，蛋白尿的微弱增加即可強烈預(yù)測糖尿病腎病的進展[5]。微量白蛋白尿不僅是慢性腎病和終末期腎病風(fēng)險因子，也是糖尿病患者總死亡率和心血管疾病死亡率以及心血管疾病發(fā)病率的有力預(yù)測指標(biāo)[6]。但不是所有蛋白尿的患者都會進展為進行性腎功能不全，10年后僅有30%～45%的患者發(fā)展為大量白蛋白尿[7]，這與腎病病程進展不符。此外，高脂肪攝入、劇烈運動、胰島素抵抗、高血壓、尿路感染等因素也影響檢測結(jié)果[8]。因此，微量白蛋白尿診斷預(yù)測糖尿病腎病的價值還存在缺陷。

目前，大多數(shù)指南推薦使用尿白蛋白/肌酐(ACR)，使用尿肌酐校正尿量可更客觀的評估尿蛋白水平。但是檢測前攝入較多肉類，肌肉劇烈運動等可影響肌酐水平，因此需要定期隨訪、多次檢測才能獲得準(zhǔn)確結(jié)果。

1.2腎小球濾過率(eGFR)：eGFR反映腎小球的濾過功能，在糖尿病腎病早期eGFR升高，晚期下降。因此eGFR并不能反映早期腎功能損害情況。此外，eGFR的改變與糖尿病腎病的病理機制無密切關(guān)系，它只是腎臟損害的結(jié)果。目前多采用血漿肌酐(Scr)計算eGFR，如改良的MDRD[9]。但Scr對糖尿病腎病診斷并不具特異性，在不存在腎小球或腎小管損傷時也可能增加。此外，性別、年齡、肌肉代謝營養(yǎng)狀況等因素對Scr的濃度影響很大。比起Scr，胱抑素C(CysC)更加穩(wěn)定，也不受肌肉質(zhì)量的影響。許多研究表明單用CysC或聯(lián)合應(yīng)用CysC、Scr的計算公式準(zhǔn)確性更高，基于CysC的公式是目前唯一發(fā)現(xiàn)的糖尿病并發(fā)癥獨立預(yù)測因子的公式[9]。盡管血清Scr計算eGFR有許多公認(rèn)的局限性，可是由于其在臨床測量方便、價格可接受，一直是腎臟損害的間接標(biāo)志。

2 新型尿液生物標(biāo)志物

糖尿病腎病病變累及腎小球、腎小管、腎間質(zhì)、腎血管等，在尿液白蛋白或eGFR改變以前，這些部位就產(chǎn)生一些微量蛋白質(zhì)隨尿液排出。尿液蛋白質(zhì)成分改變對腎臟疾病診斷具有重要價值，加之標(biāo)本無創(chuàng)收集等優(yōu)勢，尋找糖尿病腎病的早期尿液生物標(biāo)志物成為除傳統(tǒng)活檢之外的一種安全可靠的補充替代診斷方法。

2.1單一尿液生物標(biāo)志物：目前研究較多的是與腎小管/球損傷、腎臟炎性和纖維化相關(guān)的尿液生物標(biāo)志物[10]。見表1。

腎小管的主要功能是重吸收腎小球濾過的小分子物質(zhì)，高血糖導(dǎo)致葡萄糖濾過增加，腎小管重吸收負(fù)擔(dān)加重，增加腎皮質(zhì)和外髓質(zhì)的氧氣需求，誘導(dǎo)局部缺血，產(chǎn)生應(yīng)激性標(biāo)志物。研究比較多的是中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)的脂蛋白(NGAL)、腎損傷分子-1(KIM-1)。NGAL在腎小管損傷不久后就釋放，尤其是在血清Scr升高之前。Bancha Satirapoj等人對T2DM患者進行3年的隨訪，發(fā)現(xiàn)尿液中高濃度NGAL與腎功能快速下降顯著相關(guān)，與ESRD高發(fā)生率也相關(guān)[11]。Fatemeh Abbasi等人的研究也表明NGAL在腎小球損傷標(biāo)志物產(chǎn)生以前就出現(xiàn)[12]。這些結(jié)果提示NGAL可能成為早期糖尿病腎病的一個補充診斷標(biāo)志物。KIM-1是近端小管細(xì)胞頂端膜上的Ⅰ型跨膜蛋白。KIM-1與近端腎小管損害有關(guān)，代表持續(xù)的內(nèi)在腎小管損傷。Tomohito Gohda等人構(gòu)建模型評估尿液KIM-1和L-FABP(L型脂肪酸結(jié)合蛋白)對eGFR降低風(fēng)險的影響，發(fā)現(xiàn)尿液KIM-1的水平與ACR呈正相關(guān)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)，與死亡風(fēng)險增加相關(guān)[13]。Bryan R.Conway等人在大人群樣本的基礎(chǔ)上對T2DM患者進行為期4年的隨訪發(fā)現(xiàn)KIM-1/Cr、uGpnmb/Cr與腎功能下降相關(guān)，也是死亡高風(fēng)險的一個指標(biāo)[14]。這些研究結(jié)果提示KIM-1有望成為腎功能下降和死亡風(fēng)險的預(yù)測指標(biāo)。

腎小球是重要的血漿過濾器。糖尿病造成的高滲、血流動力學(xué)改變的環(huán)境會使腎小球結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變。免疫球蛋白G(IgG)在尿液中出現(xiàn)則表明腎小球濾過屏障受損。Toshio Doi等人對T2DM患者進行為期5年的隨訪，證實尿IgG4升高與白蛋白尿增加和eGFR下降的風(fēng)險增加有關(guān)，同時通過活檢確認(rèn)尿IgG4的水平也與外周腎小球基底膜的表面密度顯著相關(guān)，這是糖尿病腎病的病理改變[15]。這提示IgG4是一個潛在的糖尿病腎病預(yù)測指標(biāo)。

炎性因子介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在糖尿病腎病的發(fā)生中具有重要作用。觸珠蛋白(HPT)是炎性反應(yīng)的標(biāo)志物，是急性同種異體移植[16]，糖尿病腎病，慢性腎功能不全和腎小球腎炎等疾病的生物標(biāo)志物。Wen-Ling Liao等人的研究發(fā)現(xiàn)HPT和α-1-微球蛋白/比庫寧前體(AMBP)在區(qū)分健康個體和糖尿病患者有無腎病中具有最高能力并且在后期確證試驗中證實HCR(HPT與肌酐之比)是早期腎功能下降(ERFD)的獨立預(yù)測因子[17]。

此外，很多研究的生物標(biāo)志物涉及腎臟損傷的各個部位。在一些研究中[18]表明膠原蛋白、Ig受體、簇蛋白CD99抗原、尿調(diào)蛋白片段、α1-抗胰蛋白酶、α1-酸性糖蛋白-1在糖尿病腎病進展者中的水平也有差異。α1-抗胰蛋白酶同工酶、銅藍蛋白[19]是區(qū)分糖尿病腎病微量和非蛋白尿的潛在生物標(biāo)志物。但是這些結(jié)果大多只在糖尿病組、糖尿病腎病組與健康對照組間有差異，具體的早期診斷或預(yù)測價值還有待于做大量的縱向研究。見表1[20-29]。

2.2多個尿液生物標(biāo)志物：糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展是多因素的，涉及多個病理生理過程，如血液動力學(xué)改變、缺血與炎性反應(yīng)、腎素-醛固酮系統(tǒng)功能紊亂、遺傳和表觀遺傳調(diào)節(jié)、足細(xì)胞自噬和線粒體功能缺陷等[30]，目前尚不清楚其發(fā)病機制，也沒有發(fā)現(xiàn)一種新的生物標(biāo)志物能代替微量白蛋白用于預(yù)測糖尿病腎病的發(fā)病風(fēng)險和早期診斷。使用多個蛋白質(zhì)預(yù)測糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展可能更全面。比如CKD273[14，31]，由273種蛋白質(zhì)組成的尿肽分類器，是慢性腎病(CKD)的良好分類器。S.S.Roscioni等人通過三年隨訪并構(gòu)建了基于CKD273 的蛋白尿進展模型，結(jié)果表明CKD273可預(yù)測蛋白尿的發(fā)生進展和eGFR的變化，對糖尿病患者進行早期腎臟疾病風(fēng)險評估[14]。Petra Zürbig等人在一個縱向隊列研究中對19例T2DM患者進行10～15年的隨訪，結(jié)果表明CKD273分類器應(yīng)用于正常白蛋白尿患者時，可識別出會發(fā)展為糖尿病腎病的患者[32]。盡管研究人數(shù)少，但是它是蛋白質(zhì)組學(xué)風(fēng)險評分作為識別和治療有腎臟疾病進展風(fēng)險的2型糖尿病患者的工具的有力證據(jù)。Yongzhang Qin等人使用與腎小球/管損傷相關(guān)的生物標(biāo)志物TF(轉(zhuǎn)鐵蛋白)、IgG、β2-微球蛋白、RBP(視黃醇結(jié)合蛋白)、GAL(β-半乳糖苷酶)、NAG(N-乙酰-β-葡萄糖苷酶)構(gòu)建模型，發(fā)現(xiàn)能增加診斷準(zhǔn)確性[33]。Jong Ho Kim等人在微量蛋白尿的基礎(chǔ)之上加入非白蛋白蛋白尿，在T2DM患者中進行多年隨訪，顯著提升了疾病預(yù)測能力[34]。

以上研究表明單一生物標(biāo)志物難以全面反映疾病的發(fā)展過程，聯(lián)合使用幾種生物標(biāo)志物可提高2型糖尿病腎病診斷、預(yù)測能力。

3 尿液標(biāo)志物的研究現(xiàn)狀

一個新的生物標(biāo)志物從發(fā)現(xiàn)到進入臨床使用需要經(jīng)歷五個階段[35]。分別為：概念證明階段(①⑤)→驗證階段(②③④⑥⑦⑧⑨⑩)→評估階段→臨床使用階段→臨床驗證階段根據(jù)檢索的文獻可知，研究集中于前三個階段。盡管目前發(fā)現(xiàn)了很多與糖尿病腎病病理過程相關(guān)早期新型生物標(biāo)志物，但由于從糖尿病進展至糖尿病腎病是一個漫長復(fù)雜的過程，這給臨床實驗帶來很大困難。目前的研究嚴(yán)格終點是ESRD、死亡、ESRD與死亡結(jié)合。但是從糖尿病發(fā)生追蹤至出現(xiàn)ESRD很難也不利于研究的開展，由表1可看出，糖尿病患者出現(xiàn)早期腎功能下降[15](eGFR年平均下降超過3.3%)、由無蛋白尿進展至蛋白尿[27]、eGFR輕微下降(30%～40%)[28]、血清肌酐加倍等替代終點逐漸被采用。出現(xiàn)替代終點的結(jié)局事件所需隨訪時間更短，更利于研究。其中微量白蛋白尿或大量白蛋白尿的出現(xiàn)是有前景的候選替代終點，但是，這些替代終點尚未得到充分驗證。除此之外，在表1也可看出大多數(shù)研究都是單中心研究，人群選擇單一，樣本量過少，隨訪期較短，大部分研究沒有對新的生物標(biāo)志物進行確證實驗，這是目前研究普遍存在的問題。在長期隨訪過程中也未能納入對終點事件有影響的協(xié)變量，如治療方案等。因此證據(jù)并不足以支持進行臨床實驗。

表1 與糖尿病腎病相關(guān)的一些尿液蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物

尿液的收集與儲存方式對結(jié)果影響很大，長時間的冰凍儲存可能導(dǎo)致生物標(biāo)志物的濃度降低以及濃度變異性增加[35]。但是有研究表明尿液在-80℃可儲存8年[31]。在糖尿病腎病研究中很少提到尿液的儲存方式。常用的方法是將尿液儲存在-80℃[13]，有研究提到將收集的尿液進行分裝，在-20℃下可儲存2～5年[15]。但是都沒有提到此類儲存方式對檢測結(jié)果的影響。為了提高結(jié)果的準(zhǔn)確性與可比性，應(yīng)該標(biāo)準(zhǔn)化糖尿病腎病生物標(biāo)志物研究的樣本收集與儲存方式。

綜上所述，用于糖尿病腎病早期診斷和預(yù)測進展的生物標(biāo)志物仍然處于開發(fā)的初始階段，缺乏生物標(biāo)志物用于診斷價值的數(shù)據(jù)。盡管發(fā)現(xiàn)了很多新型生物標(biāo)志物，很少有研究在臨床中評估這些生物標(biāo)志物哪一種是最有價值的。未來的研究方向是進一步在更大規(guī)模、更大人種中評價尿液蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的診斷及預(yù)測價值，如何利用一組生物標(biāo)志物去診斷和預(yù)測糖尿病腎病。此外，生物標(biāo)志物的應(yīng)用還要綜合考慮標(biāo)本采集、檢測方法、檢測費用等因素。因此，更多多中心、大樣本、前瞻性研究有待于進一步實施。