體外HBV感染的人肝癌Huh7細胞系中葡萄糖神經酰胺合成酶活性的變化

甘 建， 楊 睿， 雷程程， 楊亞婷， 閆力婷， 田愛平， 毛小榮， 王莉莉， 李俊峰

1 蘭州大學第一臨床醫學院， 蘭州 730000； 2 蘭州大學第一醫院 感染科， 蘭州 730000；3 首都醫科大學 第十二臨床醫學院， 北京 100000

HBV是一種小包膜DNA病毒，屬于噬肝病毒科。盡管目前有乙型肝炎疫苗，但慢性乙型肝炎仍然是一個全球面臨的重大公共衛生問題[1-2]。慢性HBV感染后可能導致肝炎、肝硬化、肝細胞癌[3]，嚴重危害人類健康。在研究HBV致病機制和開發新型抗HBV藥物過程中均離不開高質量的HBV感染模型，但是，由于HBV感染條件需具備高度種屬特異性和組織特異性，使得建立合適的HBV感染模型成為制約乙型肝炎發病機制研究的瓶頸[4]。目前，已有體外感染鴨肝炎病毒和土撥鼠肝炎病毒動物模型的相關研究[5-6]，這為下一步深入研究HBV感染人類的相關機制開闊了思路。近年來，HBV體外感染模型也有一定的進展，并能構建出穩定表達HBV的細胞系[7]。人源化的肝臟衍生細胞與人類親緣關系近，克服了HBV感染的種屬特異性和組織特異性，是研究HBV感染、發病機制和開發藥物的有效方法。

鞘脂是細胞膜結構的重要組成部分，是由鞘氨醇、脂肪酸和磷酸膽堿組成的兩性脂類，鞘氨醇是所有鞘脂共同的基本結構骨架，其上連接脂肪酸衍生物則構成神經酰胺(ceramide，Cer)，是鞘脂代謝的中心分子[8]。Cer進一步在頭基位置上連接一個磷酸膽堿則構成鞘磷脂類，如果其頭基位置連接的是聚糖分子則構成糖鞘脂類，如連接葡萄糖則構成葡萄糖神經酰胺(glucosylceramide，GC)。Cer到GC的轉變由葡萄糖神經酰胺合成酶(glucosylceramide synthetase，GCS)催化，該酶是糖鞘脂代謝的關鍵酶[9]。GCS參與眾多病理生理過程，在細胞增殖、凋亡、耐藥等方面扮演重要角色[9-11]。同時，在眾多癌癥中亦觀察到GCS過度表達，GCS可促進相關惡性腫瘤發生發展，這表明開發出一些GCS的抑制類藥物可能是好的治療靶點[12]。近來，GCS與肝臟疾病的相關研究日益受到關注，并為肝病的診治提供了一種有效策略。然而，GCS與HBV所致病毒性肝炎的關系的研究極為少見，以及GCS活性在HBV感染過程中的變化仍不明確。本研究在能較好的模擬HBV感染的體外模型基礎上進行研究，并探索糖鞘脂代謝關鍵酶GCS在HBV感染體外細胞系過程中的活性變化。

1 材料與方法

1.1 材料收集 收集2019年6月—8月就診于蘭州大學第一醫院感染科的9例初治急性乙型肝炎患者的血液標本，所有患者HBV DNA滴度>9.9×107IU/ml；另選7例健康體檢者的血液標本作為對照，其HBV定量均為陰性。

1.2 試劑和儀器 碘海醇購自Axis-shield公司(挪威)，Huh7細胞系購自普諾賽生命科技有限公司(武漢)，胎牛血清、DMEM和青-鏈霉素雙抗購自Biological Industries公司(以色列)，超速離心管和Himac超速離心機購自日立公司(日本)，礦物油購自sigma公司(美國)，熒光定量PCR試劑盒購自天隆生物科技有限公司(蘇州)，引物合成(英濰捷基有限公司，上海)，相差顯微鏡購自Olympus公司(日本)，人GCS-Elisa試劑盒購自江萊生物有限公司(上海)，熒光定量PCR儀、人HBsAg檢測試劑盒Elecsys HBsAg Ⅱ quant Ⅱ、Cobas e 601全自動免疫分析儀-電化學發光法購自Roche公司(瑞士)。

1.3 HBV顆粒純化 使用DMEM培養基溶解碘海醇，定容到10 ml，4 ℃，旋轉過夜溶解，用孔徑為0.22 μm濾膜過濾除菌。用無菌DMEM培養基稀釋質量體積比為42%、33%、25%、16%和8%的碘海醇溶液，在超速離心管內從高濃度到低濃度組份分別依次加入1.42 ml碘海醇溶液，然后在上部載入1.5 ml含有HBV的患者血清，最后在最上部蓋上預冷礦物油。在超速離心機上以35 000 r/min，4 ℃的條件離心5.2 h，設置加減速為升4降5。離心完畢后取出離心管，棄掉表面礦物油，從上到下先取1 ml組份4個，然后取400 μl的組份分離離心以收集病毒。以上病毒實驗的操作在二級安全實驗室生物安全柜內嚴格按照相關規定操作。

1.4 細胞培養 人肝癌細胞系(Huh7)在含有10%胎牛血清、2 mmol/L的L-谷氨酰胺、4.5 g/L葡萄糖、2%DMSO、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基中培養。在培養瓶中接種約106個細胞，每1～2 d更換培養基1次。將從HBV陽性血清超速離心純化所得病毒通過real-time qPCR的方法進行檢測，選擇病毒含量最高的4個組分進行混合，用于感染細胞。

1.5 HBV感染細胞 在接種后2～6 d，感染組用患者血清的1 ml HBV感染顆粒感染Huh7細胞系，對照組用來自健康體檢者的血清共培養。在37 ℃溫育3 h后，除去接種物后用PBS徹底洗滌細胞，并向細胞中加入補充有10-4mol/L地塞米松和10-5mol/L胰島素的完全培養基。將培養物溫育1 d，洗滌3次，并再次用新鮮培養基培養，孵育1 d。然后將細胞保持在補充有10-6mol/L地塞米松和10-6mol/L胰島素的完全培養基中，每2 d更換培養基1次。待培養結束后收集細胞，采用反復凍融法裂解細胞，收獲細胞胞漿，分別在4 h、8 h、2 d和5 d檢測HBV抗原和HBV DNA。

1.6 細胞胞漿DNA測定 通過使用熒光定量PCR儀進行HBV DNA定量。用于實時PCR反應的引物和探針序列為：正向引物，5′-CCGTCTGTGCCTTCTCATCTG-3′；反向引物，5′-AGTCCAAGAGTYCTCTTATGYAAGACCTT-3′；探針，5′-FAM-CCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGC-TAMRA-3′。擴增設置為0.8 μmol/L引物和0.2 μmol/L探針，總體系為20 μl。擴增條件為95 ℃預變性3 min，然后以94 ℃、15 s，60 ℃、30 s擴增45個循環。

1.7 HBsAg檢測 將上述分離出的HBV感染的Huh7細胞胞漿和培養液上清采用電化學發光法全自動分析儀進行檢測，具體操作步驟嚴格按照儀器說明書實行，簡單來說：(1)將冷藏的人HBsAg平衡至室溫(20 ℃～25 ℃)，放置于分析儀的試劑盤內，并將試劑盒附帶的定標液放置于分析儀的樣本區，隨后分析儀自動完成定標過程；(2)定標完成后，棄去定標液，在分析儀各對應樣本區放置待測樣本，分析儀會對樣品進行1∶400稀釋并讀取結果。以上過程由分析儀自動進行。

1.8 GCS活性檢測 將上述分離出的HBV感染的Huh7細胞胞漿和培養液上清采用ELISA法檢測GCS活性，具體操作步驟嚴格按照儀器說明書實行。

1.9 倫理學審查 本研究方案經由蘭州大學第一醫院倫理委員會的批準，批號： LDYYLL2018-100，患者均簽署知情同意書。

2 結果

2.1 細胞感染前后變化 正常培養的細胞呈多邊形或類圓形、有立體感，邊界清晰，細胞核位于正中。對照組細胞符合上述特點，培養2d后細胞明顯增多。干預前的感染組細胞同樣符合正常培養的細胞特點，感染HBV并培養2 d后細胞數量較感染前和對照組明顯減少，其細胞體積腫脹，細胞膜破碎，表面出現胞膜皰，胞質顆粒粗糙，部分細胞脫壁，由于大部分細胞破碎脫落后可見核已消失的細胞胞漿或殘屑(圖1)。

圖1 各組細胞干預前后生長情況(×40)

2.2 不同時間點感染組細胞中HBsAg和HBV DNA的表達量 感染4 h、8 h、2 d和5 d后胞漿中HBsAg表達量均高于感染前(P值均<0.05)，表明HBV成功感染Huh7細胞系；與感染4 h相比，感染8 h、2 d和5 d后胞漿中HBV DNA表達量明顯升高(P值均<0.001)，并在感染2 d后HBV DNA達到最高(表1)。

表1 各時間點HBV感染細胞胞漿中HBsAg和HBV DNA的表達量

2.3 GCS在HBV感染細胞中的活性變化及和病毒的相關性 在HBV感染期間，隨著病毒復制的增加，GCS活性呈現出增高的特點，從HBV感染4 h開始逐漸升高，并于感染2 d達到高峰，隨后表現出下降趨勢(表2)。感染2 d與對照組相比，差異有統計學意義(t=3.956，P=0.016 7)。Pearson相關性分析顯示，GCS活性與HBV DNA存在顯著正相關關系(r=0.576 8,P=0.047 1)(圖2)。

表2 GCS在HBV感染期間的活性變化

圖2 GCS活性與HBV DNA相關性

3 討論

原代肝細胞是HBV感染的理想細胞，但由于其不能連續傳代限制了其在研究中的使用。近期有學者發現，在將病毒接種到細胞之前去除細胞表面結合的脂蛋白有利于HBV感染肝細胞的入胞過程和后續HBV DNA的復制[13]；也有研究[14]表明，Na+牛黃膽酸協同轉運多肽為功能性HBV受體，通過對常用的肝細胞衍生細胞(即HepG2和Huh7)中重建表達Na+牛黃膽酸協同轉運多肽后，細胞對HBV感染效率明顯增強，促進了HBV生命周期早期感染機制和治療的研究。本研究正是利用肝臟細胞衍生細胞Huh7，采用乙型肝炎患者HBV DNA高拷貝血清通過進一步純化后進行感染。結果顯示，在感染初期DNA復制低，這可能是HBV剛進入細胞后，進行復制、繁殖，生成成熟的病毒顆粒需要一段時間，也可能與外源DNA純度有關。經過一段時間的培養后(即從8 h開始)病毒在細胞內進行持續復制并高表達，以上初步確定HBV DNA可以進入Huh7并進行復制。實驗過程中添加了適量的胰島素，其可以通過激活細胞轉錄因子調節HBV X蛋白的表達，將HBV基因組整合到細胞DNA中，以促進HBV進入細胞并進行復制[15]；同時還通過梯度離心對HBV顆粒進行提純，也增加了HBV感染細胞的概率。

研究[16-17]表明鞘脂家族成員在病毒性肝炎中扮演重要角色，如機體對抗病毒治療的反應會伴隨血清鞘脂水平變化，鞘脂在慢性病毒性肝炎感染中被認為是有希望的新生物標志物。但目前關于糖鞘脂代謝的關鍵酶GCS與病毒性肝炎的直接研究鮮有報道。由于HBV等哺乳動物病毒并沒有獨立編碼自己的碳水化合物修飾的酶系統，只能利用宿主細胞糖基化機制來修改其病毒糖蛋白，如病毒糖蛋白的折疊[18]，以達到侵入細胞并進行感染的目的，因此糖基化酶可能是病毒進行侵入和感染的重要物質。如果給予相應的糖基化酶抑制劑則可能干擾病毒糖蛋白的折疊，發揮抗病毒感染的作用。雖然目前并無GCS抑制劑直接用于抗病毒的證據，但GCS抑制劑用于其他疾病特別是癌癥相關研究已得到充分證明[12,19]，并且其在抑制細菌生長方面也有顯著成效[20]。糖鞘脂存在于所有哺乳動物細胞膜上，細胞膜是外界微生物入侵細胞的門戶，因此糖鞘脂常被細菌和病毒用作受體并不稀奇。在糖鞘脂結構中，其脂性部分常常鑲嵌入質膜中，而糖鏈部分則留在細胞外。糖基化會極大程度的改變原本脂質的功能特性，如Cer可通過誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡發揮強大的抗癌作用，而其糖基化后的產物則產生截然相反的作用[9]。GCS作為糖鞘脂代謝的首部關鍵酶，其活性決定著細胞內Cer/GC的平衡，并影響細胞功能狀態，進而影響HBV感染細胞成功與否。本研究發現在HBV感染Huh7期間，隨著病毒復制的增加，GCS活性逐漸升高，這與上述觀點相符合，因為病毒持續復制并感染越來越多的細胞，可能需要借助宿主細胞GCS修飾其病毒糖蛋白，協助病毒入侵細胞膜和轉運的過程，當然這一過程也不能排除其糖基化產物在其中所起的作用。在之后，GCS的活性隨著HBV DNA復制的減少而降低，以上初步表明GCS活性可能與HBV的感染有關，糖鞘脂代謝與乙型肝炎有密切的聯系。

理想的HBV感染模型應該具備HBV感染率高、感染維持的時間長，且感染后能發生相應病理改變的優點，最好同時具有正常免疫系統，以便于評價免疫反應。雖然HBV感染的實驗動物模型研究與應用已取得了較大進展，但除靈長類動物外的其他動物與人類親緣關系較遠，在模擬HBV感染人的致病機制和相應的病理生理改變方面存在較大限制。由于人體肝組織樣本和靈長類動物模型來源十分有限，難以滿足龐大的實驗需求，所以人源化的衍生細胞系則具有重要的潛在應用價值。該細胞與人類親緣關系近，易于被HBV感染，能極好的再現HBV感染人體的變化過程，但其也存在明顯的缺點，由于體外細胞不具備體內完整的免疫系統，并且該細胞仍未達到理想的感染效率，因此不能觀察到相應的免疫反應。

另外，本研究只是對GCS活性與HBV感染關系的初步研究，未能深入到具體機制。糖鞘脂家族成員眾多，涉及的化學反應非常復雜，彼此間聯系緊密。GCS作為糖鞘脂代謝的關鍵控制點，其活性直接決定著Cer/GC的平衡，從而對細胞命運起決定性作用，并能在一定程度上影響相關肝臟疾病的結局，如病毒性肝炎和肝細胞癌等。因此，有必要進一步研究GCS，在將來，GCS可能成為相關肝臟疾病的治療靶點。

總之，本研究通過嘗試在體外模擬HBV感染的特點，在此基礎上探討了糖鞘脂合成關鍵酶和HBV復制的可能關系，研究提示糖鞘脂的合成可能與HBV的復制有關，兩者之間的密切關系有可能是HBV感染的新的關注點。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：甘建、楊睿負責課題設計，資料分析，撰寫論文；雷程程、楊亞婷、閆力婷、王莉莉參與臨床資料收集，數據分析；田愛平、毛小榮、李俊峰負責擬定寫作思路，指導撰寫文章，修改論文并最后定稿。