胞外ATP對殼聚糖誘導的ROS和PAL活性變化的影響

楊德麗 王娟娟 龐海龍 孫 坤 馮漢青

（西北師范大學生命科學學院，蘭州 730070）

殼聚糖（chitosan，CTS）是一種天然的高分子聚合物，具有無毒、抑菌、生物相容及生物降解等多種優良特性［1］。研究表明，殼聚糖可作為植物的生長調節劑，促進植物種子的萌發、根的伸長和幼苗的生長發育［1］。此外，也有許多研究結果表明，殼聚糖還可誘導植物脅迫抗性的提高，有利于植物抵抗各種真菌、細菌、昆蟲等生物脅迫以及鹽、干旱、重金屬等非生物脅迫［1，2～5］。

大量研究表明，在殼聚糖調節植物生長及激活植物抗性反應過程中通常會激發兩種植物細胞的生理學反應：①殼聚糖可誘導植物細胞活性氧（ROS）的產生［6～8］；ROS 作為植物體內一類重要信號分子，可參與調節植物的生長發育和逆境脅迫響應；同時也可直接作用于各種病原微生物抑制其生長［9］。②殼聚糖可激活植物苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性［8，10］；PAL 是苯丙烷途徑的關鍵酶和限速酶，廣泛參與植物生長發育的多種生理活動［11］，其通過提高木質素的合成從而參與了植物生長發育和抵御病原微生物；此外，PAL 參與合成植物花青素和黃酮等物質的產生，從而提高了植物抵御生物和非生物脅迫的能力［12～13］。因此，ROS水平和PAL 活性變化被認為是殼聚糖所引起的植物標志性生理學響應。

三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）是生物體內重要的分子，參與多種代謝反應。傳統觀念認為ATP 主要在細胞內部發揮功能，作為能量分子參與細胞的代謝活動。但近年來的研究表明，細胞內部的部分ATP 可通過ABC 轉運載體蛋白、陰離子通道或膜泡運輸的方式被轉運到胞外，從而形成了胞外ATP（extracellular ATP，eATP）［14］。Choi 等［15］在擬南芥中發現了第一個胞外ATP 受體DORN1，為闡明植物細胞胞外ATP 信號傳導過程奠定了基礎。和細胞內部的生理學角色不同，胞外ATP 主要作為一種重要的信號分子，在植物生長發育和細胞基礎代謝中發揮重要功能，并且參與植物細胞對重金屬脅迫、滲透脅迫、機械刺激等多種脅迫的響應［16～21］。

大量研究表明，胞外ATP 水平對于植物細胞的活性氧水平具有明顯的調節作用［16～17，20］。盡管沒有對PAL 的生理學活性進行測量，但Wu［22］等的研究表明胞外ATP 的水平對植物PAL 編碼基因具有調節作用。上述研究表明，植物ROS 和PAL 受到了胞外ATP 水平的調節。而如上所述，ROS 水平和PAL 活性變化是殼聚糖所激發的典型的植物細胞生理學反應，但胞外ATP 對殼聚糖誘導的這些生理學變化是否具有影響在國內外尚無報道。基于此，本實驗以煙草懸浮細胞為材料，初步探討了胞外ATP對殼聚糖引起細胞ROS水平和PAL活性變化的影響，以期能夠進一步了解胞外ATP 的生理學作用，也為殼聚糖誘導的植物生理學變化的調控機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

煙草懸浮細胞（Nicotiana tabacum L.cv.Bright Yellow-2）由姜里文教授（中國香港大學）饋贈。使用添加了質量分數為3%蔗糖和0.4 mg·mL-12，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）的MS（Murashige-Skoog）液體培養基在25℃、130 r·min-1黑暗條件下振蕩培養。實驗中使用繼代培養至對數期的懸浮細胞，所有步驟均在無菌條件下完成。殼聚糖購自北京索萊寶科技有限公司，來源于蝦蟹殼，脫乙酰度約為90%。使用1%的乙酸溶解，放于60℃至完全溶解，用1 mol·L-1NaOH 調pH 至5.7，之后用無菌水定容，高壓滅菌后備用［23］。

1.2 煙草懸浮細胞的處理

取一定體積繼代培養至對數期的煙草懸浮細胞，進行以下處理：①在煙草懸浮細胞中加入終濃度為5、10、15、20μg·mL-1殼聚糖；②在煙草懸浮細胞中加入終濃度為10、20、30、40 μmol·L-1ATP；③在煙草懸浮細胞中分別加入20 μmol·L-1ATP、20 μmol·L-1ATP+10 μg·mL-1的殼聚糖溶液或10μg·mL-1的殼聚糖溶液，對照中加入等體積的無菌水。在25℃黑暗條件下振蕩孵育30 min 后，進行各項指標的檢測。

1.3 細胞內ROS水平的測定

參照NavdeepKaur 等［24］報道的方法。取待測的細胞懸浮液475 μL，加入25 μL H2DCFDA（2′，7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate），黑暗孵育5 min，繼而加入800 μL 磷酸緩沖液，離心3 min（3 000 r·min-1），棄上清液，將樣品置于熒光顯微鏡下（Leica，DM5000 B，Wetzlar，德國）進行成像觀察（20×），并采用Image J軟件分析細胞內ROS熒光強度。

1.4 細胞PAL活性的測定

參照王敬文等［25］改進的方法。取煙草細胞，每0.2 g 細 胞 加 入1 mL 預 冷 的0.05 mol·L-1pH 為8.8 的硼酸緩沖液（含5 mmol·L-1巰基乙醇）和0.02 g聚乙烯吡咯烷酮，冰浴研磨成漿，在4℃，10 000 r·min-1下離心15 min，抽取上清液為酶提取液。檢測液組成為0.5 mL 酶提取液、2.5 mL pH8.8 硼酸緩沖液、1 mL 0.02 mol·L-1L-苯丙氨酸（用0.1 mol·L-1pH8.8 硼酸緩沖液配制）和1 mL 蒸餾水，總體積為5 mL。反應液置于30℃水浴中，反應30 min 后加6 mol·L-1HCl 0.1 mL 終 止 反 應。在290 nm 下 測OD 值，以每分鐘每毫升酶液OD 值變化0.01 為1個酶活性單位。

1.5 細胞eATP水平的測定

取待測懸浮細胞加入1 mL 離心管中，離心4 min（4℃，4 000 r·min-1），吸取上清，每100μL 待測樣品加入100μL 螢火蟲尾部提取物溶液，迅速混勻，測定其熒光強度，根據測定熒光的強弱，得出相應ATP的濃度［26］。

1.6 數據分析

使用Microsoft office Excel 2010 進行數據整理，實驗結果均用平均值±標準差表示，使用Ori?gin 9.0 軟件對數據進行雙總體t檢驗，在P<0.05 上有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖和外源ATP 對細胞內ROS 水平和PAL活性的影響

隨著殼聚糖（CTS）濃度的升高，細胞內ROS的熒光強度逐漸升高（見圖1：a～e，圖2）。且均顯著高于CK，其中5 μg·mL-1殼聚糖處理使細胞內的ROS熒光強度約為CK的1.4倍，而10、15和20μg·mL-1殼聚糖處理使細胞內ROS 水平進一步增加，分別增至CK 的3.4、4.6 和6.4 倍。使用5～15μg·mL-1殼聚糖處理，使細胞內PAL 活性顯著增加，且均顯著高于CK，其中15 μg·mL-1殼聚糖處理下PAL 活性最高，為CK 的1.4 倍（見圖3）；當殼聚糖濃度達到20μg·mL-1，PAL 活性有所下降，但仍然高于對照。不同濃度外源ATP 處理下，細胞內ROS 的熒光強度和PAL 活性均無顯著變化（見圖1：f～j、圖4～5），選擇20μmol·L-1的外源ATP進行后續實驗。

2.2 殼聚糖對細胞胞外ATP水平的影響

不同濃度的殼聚糖處理下，胞外ATP 水平均顯著低于CK（見圖6）。5 和10 μg·mL-1殼聚糖處理下，胞外ATP 水平分別降低至CK 的0.7 和0.4倍；15μg·mL-1殼聚糖處理下胞外ATP水平降低為CK 的0.09 倍。在20 μg·mL-1殼聚糖處理下，胞外ATP 水平有一個回升，但仍然顯著低于CK，約為CK的0.3倍。

2.3 外源ATP 對殼聚糖誘導下細胞內ROS 和PAL活性的影響

本研究選擇在10 μg·mL-1殼聚糖處理濃度下探究外源ATP對殼聚糖誘導的ROS水平和PAL活性變化的影響。在用10 μg·mL-1殼聚糖處理30 min 后，細胞內ROS 水平急劇升高約為CK 的2.8倍。單獨用20μmol·L-1的外源ATP 處理未引起細胞內ROS 水平的顯著變化。而在10μg·mL-1殼聚糖處理的細胞中加入20μmol·L-1的外源ATP 則使細胞內ROS 水平顯著降低，約降為殼聚糖處理細胞的0.6倍（見圖1：k～n，圖7）。

用10 μg·mL-1殼聚糖處理使得細胞PAL 活性顯著升高。單獨用20μmol·L-1的外源ATP 處理使得細胞PAL 活性有輕微上升，但未達到顯著水平。而較之殼聚糖處理的細胞，在10μg·mL-1殼聚糖處理下加入20μmol·L-1的外源ATP 使PAL 活性顯著降低，約殼聚糖處理的細胞的0.8倍（見圖8）。

3 討論

活性氧（ROS）可以作為信號分子調控植物生長發育并參與激活防御反應。已有研究表明，蛋白或寡糖等激發子均可誘導煙草ROS 的釋放［27～28］。本研究發現，在用殼聚糖誘導處理煙草懸浮細胞30 min 后細胞內ROS 便顯著升高，并且誘導ROS水平的高低與其濃度密切相關。苯丙氨酸解氨酶（PAL）在植物生長、次生代謝物合成及抗逆過程中有重要作用［13～14］。試驗發現，殼聚糖誘導處理后煙草懸浮細胞PAL 活性先隨殼聚糖濃度的增加而升高，在15μg·mL-1殼聚糖處理下PAL活性達到峰值，此后在20 μg·mL-1殼聚糖處理下PAL 活性有所下降，但仍然高于對照。不同濃度外源ATP處理下未引起ROS水平和PAL活性的顯著變化。而和ROS 水平和PAL 活性變化不同的是，殼聚糖處理下煙草懸浮細胞胞外ATP 含量顯著下降。

Amborabe?［29］等研究發現殼聚糖的作用部位主要位于細胞質膜，其能夠激活植物細胞質膜H+-ATP 酶的活性，促進生物膜去極化并誘導一系列相關事件的發生。因此，殼聚糖可能通過激活植物細胞質膜ATP 酶活性，進而促進胞內ATP 水解，ATP 通過轉運載體蛋白或者胞吐等作用從胞內釋放到胞外的ATP 量減少，同時作為次級代謝信號分子，質子跨膜流動也會引起ROS 水平升高并伴隨防御基因的表達及抗性相關酶PAL 活性的升高。因此，我們認為胞外ATP 水平的降低可能是殼聚糖誘導植物早期反應的關鍵條件之一。

為了進一步判斷胞外ATP 對殼聚糖誘導的ROS 和PAL 活性變化是否具有影響，我們在10μg·mL-1的殼聚糖處理的煙草懸浮細胞中比較了外源施加ATP和未施加ATP后ROS含量和PAL活性的不同。結果顯示，在殼聚糖處理的煙草懸浮細胞中施加20μmol·L-1外源ATP 可顯著降低殼聚糖引起的ROS水平和PAL 活性的升高，這提示，胞外ATP水平可負向調節殼聚糖引起的ROS水平和PAL活性的升高。

研究表明，外源ATP 處理可引起作物的抗氧化酶活性顯著增強，從而減少ROS的積累［30-31］。此外，Chivasa 等［32］發現，用800 μmol·L-1的外源ATP處理煙草葉片導致了超氧化物歧化酶蛋白含量的顯著性上升。我們實驗室之前的工作也發現，外源ATP能夠減少鉛脅迫下煙草懸浮細胞ROS的上升，并顯著上調植物的抗氧化酶活性［33］。因此，胞外ATP 可能通過提高植物的抗氧化酶活性而減少殼聚糖引起的ROS的升高。Wu等［22］發現，對傷處理的番茄葉片施加細胞外ATP 水解酶（降低了細胞外ATP 水平）導致了PAL 編碼基因表達量的上升，提示胞外ATP 負向調節PAL 編碼基因的表達。因此，推測在殼聚糖引起的PAL 活性升高過程中胞外ATP 水平可能通過影響PAL 編碼基因的表達而負向調節了PAL活性。

以上研究表明，胞外ATP 水平至少可負向調節殼聚糖引起的ROS水平和PAL活性的升高。盡管胞外ATP 對殼聚糖所引起的這些生理學變化的負向調控的意義尚不清楚。但有部分研究發現，人為增加植物細胞胞外ATP 水平會降低植物對病毒和細菌的抗性；而降低植物細胞胞外ATP 水平會增加植物對病毒和細菌的抗性［34～35］。另有研究發現，減低植物的胞外ATP 水平會增加植物對低溫的耐受［36］。

這些工作提示，在某種環境下植物需要降低胞外ATP 水平以增強自身的抗性反應。因此，殼聚糖處理下煙草懸浮細胞胞外ATP 含量下降可能是植物細胞加強ROS 水平和PAL 活性所需要的，從而增強了殼聚糖的生理學效應。其具體機制尚待進一步揭示。