金花茶花瓣轉錄組分析及花瓣發育調控基因挖掘

李 博 劉合霞 劉 秦 周興文

（廣西農產資源化學與生物技術重點實驗室，玉林師范學院，玉林 537000）

金花茶（Camellia nitidissima）是山茶科（Thea?ceae）山茶屬（Camellia）植物，主要分布于我國廣西南部地區及越南北部地區，是山茶屬中唯一具有金黃色花瓣的珍稀植物類群，素有“茶族皇后”“植物界的大熊貓”的美譽［1］。金花茶花瓣金黃色，具有較高的觀賞價值，同時也是一種藥食兩用植物，含有茶多酚、茶多糖、黃酮類等生理活性成分，此外還含有對人體健康有益的多種微量元素，如鍺、錳、有機硒等元素［2］，具有清熱解毒、利尿消腫等功效，可用于治療高血壓、咽喉炎、便血、痢疾、月經不調等疾病，另外，現代藥理學的研究也表明金花茶具有殺菌、抗癌、防治“三高”等作用［3～5］。金花茶的花朵是主要的開發利用資源，而它的觀賞性和藥用價值很大程度上取決于花瓣的顏色及大小。因此，對金花茶花瓣發育進行研究具有重要的現實意義。

花瓣在大小、形狀和顏色上變化很大，這種變異對異交物種中吸引傳粉昆蟲具有重要的適應性意義［6～7］。花瓣一直是園藝家們選擇改良的目標，通過對花瓣性狀的改良可以提高植物的觀賞價值［8］。目前，花瓣已經成為植物器官發生研究的一個獨特模型系統，因為花瓣對于植物的生長是可有可無的，花瓣存在與否對植物自身的生存能力影響相對較小［9］；此外，花瓣的形狀和大小在很大程度上不受環境波動的影響［10］，上述特點使得它成為了分析器官發育的理想遺傳控制系統。

在金花茶花瓣的發育過程中，其花瓣表型會發生明顯的變化。這一過程始于綠色小花瓣的形成，它經歷了一個主要由細胞分裂驅動的早期生長階段，并伴隨著色素開始合成；此時，花瓣細胞生長緩慢，但色素含量迅速增加，直至產生色素沉著，形成黃色的花瓣；隨后，通過花瓣細胞的擴張，使花瓣達到最終的大小。雖然許多研究探討了模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）花瓣的生長發育 調 控 機 制［11］，玫 瑰（Rosa chinensis）［12］、菊 花（Chrysanthemum morifolium）［13］等園藝植物花瓣伸長的調控機制，以及金花茶花瓣的色素苷生物合成的相關基因及調控機制［14］，但是控制金花茶花瓣發育及伸長的調控機制卻知之甚少。隨著測序技術的發展，RNA-seq 測序可用于分析整個轉錄組，通過檢測unigene 表達的變化，可得到大規模的基因表達數據集。因此，本研究對不同發育時期的金花茶花瓣進行了轉錄組分析，以期揭示激素信號轉導與轉錄因子家族在花瓣生長調控中的關系，建立與金花茶花瓣生長相關的基因網絡信息，為深入研究金花茶花瓣在轉錄水平上的發育調控機制奠定理論基礎，為金花茶分子育種實踐及資源開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 金花茶花瓣轉錄組數據的獲取及分析

此次研究所使用的數據來源于本課題組前期測序所獲得的金花茶花瓣轉錄組測序數據。在前期的研究中，根據花瓣的表型特征，將金花茶的開花過程劃分為幼蕾期（S1）、初蕾期（S2）、顯色期（S3）、半開期（S4）、盛開期（S5）等5 個時期（見圖1），采集每個時期的花瓣進行3 次轉錄組重復測序，共獲得15個轉錄組測序樣本，該數據已上傳至NCBI（national center for biotechnology information）數據庫，獲取碼為PRJNA392895［14］。

將原始測序數據（Raw reads）中低質量的序列讀序（Reads）去除，然后使用Trinity 軟件［15］組裝干凈讀序（Clean reads），并對其進行拼接，進而獲得轉錄本序列（transcripts）；將轉錄本進行同源聚類和拼接，從而得到unigene；隨后利用公共數據庫（Nr，Swiss Prot，KOG，Pfam，GO，KEGG）對得到的金花茶花瓣的unigene進行注釋，要求E值<1E-5。

1.2 金花茶基因表達水平分析及差異表達基因的篩選

利用軟件RSEM［16］，把15 個樣品中的干凈序列（Clean reads）與Trinity 軟件拼接得到的金花茶轉錄組參考序列進行比對，統計在每個樣品中比對到每個基因上的reads 的數目（Readcount），并將其轉換成FPKM 值（expected number of Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions base pairs sequenced）［17］，分析開花過程中金花茶基因的表達水平。隨后采用DESeq 軟件［18］，檢測不同開花時期花瓣的差異表達基因（differentially ex?pressed genes，DEGs），將5 個時期的金花茶花瓣轉錄組數據，根據開花過程的先后順序進行兩兩比對，獲得了S2-VS-S1、S3-VS-S2、S4-VS-S3和S5-VSS4等4個比較組，篩選其中的差異表達基因，篩選標準設為FDR≤0.001，差異倍數大于2，且Padj<0.05。

1.3 開花過程中金花茶差異表達基因的富集分析及趨勢分析

對所獲得的金花茶差異表達基因的GO 功能富集，主要采用GOseq 進行分析［19］；而對于所有金花茶差異表達基因KEGG 通路的富集分析，則主要采用KOBAS（2.0）來完成［20］，通過對金花茶花瓣差異表達基因的富集分析，進而挖掘開花過程中調控金花茶花瓣發育的相關基因。為了分析不同開花時期金花茶的基因表達趨勢，首先，根據花朵開放的先后順序，對5個不同開花時期的金花茶花瓣轉錄組數據進行兩兩比對；然后再利用STEM 軟件［21］，對4個比較組的所有差異表達基因進行趨勢分析，進而篩選顯著性的基因表達集合，顯著性的篩選標準為P<0.05。

1.4 開花過程中金花茶高表達基因的篩選及富集分析

為研究高表達基因在金花茶花瓣發育過程中的功能，計算每個unigene 在花瓣發育5 個時期的FPKM 平均值，將FPKM 均值大于100 的unigene 認為是高表達基因［22］；隨后利用KOBAS（2.0）對高表達基因進行KEGG代謝通路富集分析。

1.5 金花茶差異表達基因的實時熒光定量PCR驗證

隨機選擇3 個在金花茶花瓣發育中差異表達基因，使用Primer Premier（5.0）軟件設計基因特異性引物，進行實時熒光定量PCR 驗證。利用試劑盒（Invitrogen）將提取到的各樣品RNA 反轉錄為cDNA，隨后以cDNA 為模板，選擇18S rRNA 作為內參基因，在ABI 7500FAST 熒光定量PCR 儀（ABI公司，美國）進行熒光定量檢測。反應按照SYBR Green Dye 試劑盒說明書進行操作，本實驗中每個樣品進行3次技術重復，采用2-??CT法計算差異基因的相對表達量［23］。

2 結果與分析

2.1 金花茶開花過程中差異表達基因分析

根據花朵開放的先后順序，對5個不同開花時期的金花茶花瓣轉錄水平進行兩兩比對，4個比較組中共獲得了1 922個差異表達基因（見圖2）。在S2 與S1 比較組中，共檢測到76 個差異表達基因；在S3 與S2 的比較組中，檢測到的差異表達基因數量有較大的增加，為325個；而在S4與S3的比較組中，檢測到的差異表達基因數量則最少，僅有11個；最后在S5 與S4 的比較組中，檢測到的差異表達基因為1 473個，數量最多，其中870個差異表達基因上調表達，603個下調表達；結果表明，金花茶的半開期（S4）與盛開期（S5）可能是金花茶開花過程中比較關鍵的階段，這兩個階段的差異表達基因可能在開花的調控機制中具有重要的作用。對4 個比較組中的1 922 個差異表達基因進行GO 功能注釋，3 個一級分類單位包含37 個二級分類功能組。生物學過程中所包含的二級分類單位數量最多，有17個，差異表達基因主要集中在代謝進程（metabolic process）、單有機體進程（single-organ?ism process）、細胞進程（cellular process）等二級分類單位中；其次為分子功能，該分類單位主要集中在催化活性（catalytic activity）、結合（binding）、轉運活性（transporter activity）等二級分類單位中；而細胞組分所含的二級分類單位則最少，且主要集中在細胞膜（membrane）、細胞膜部分（membrane part）和細胞（cell）等分類單位中。GO 功能分類結果表明金花茶花瓣差異表達基因的表達主要與代謝進程、單有機體進程、細胞進程、催化活性、結合等相關聯（見圖3）。

2.2 金花茶差異表達基因的富集分析

對4個比較組中獲得的1 922個差異表達基因進行GO功能富集分析，3個一級分類單位，生物過程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）及 細 胞 組 分（Cellular Component，CC）分別富集到17、9、11 個二級生物過程，其中富集達到顯著水平的GO 分類共有33 個，主要有水解酶活性（GO：0016787）、酶抑制劑活性（GO：0004857）、催化活性（GO：0003824）、糖類化合物代謝過程（GO：0005975）、碳—氧裂解酶活性（GO：0016838）、生物膜（GO：0016020）等（見圖4）；其中二級GO 分類單元催化活性（catalytic activity，GO：0003824），它所含有的三級GO 分類單元水解酶（hydrolase activity，GO：0016787）、四級GO 分類單元糖基鍵水解酶（hydrolase activity，acting on glyco?syl bonds，GO：0016798）、五級GO 分類單元水解O-糖基化合物水解酶（hydrolase activity，hydrolyz?ing O-glycosyl compounds，GO：0004553）均表現為顯著富集，這些分類單元包含的unigene 以木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶（（Xyloglucan endotransgluco?sylase/hydrolase，XTH）為主，GO 功能富集分析結果表明，金花茶開花過程中差異表達基因的功能主要與糖的合成、分解與代謝，酶的活性與催化，化學鍵的生成與斷裂，生物膜的合成以及電子載體活性有關。而1 922 個差異表達基因被富集到了77條KEGG 的Pathway 中，其中富集達到顯著水平的KEGG 通路共有9個，具體的通路為類苯基丙烷生物合成（ko00940）、類黃酮生物合成（ko00941）、次生代謝物的生物合成（ko01110）、植物晝夜節律（ko04712）、油菜素甾醇生物合成（ko00905）、戊糖和葡萄糖醛酸轉化（ko00040）、角質，亞氨酸和蠟生物合成（ko00073）、代謝途徑（ko01100）和醚脂類代謝（ko00565）（見圖5）。KEGG富集分析結果發現，金花茶花瓣差異表達基因的功能主要與次生物質代謝、激素合成與傳導、糖類和脂類物質轉化有關。

2.3 調控金花茶花瓣發育的基因挖掘

為尋找調控金花茶花朵開放及花瓣發育的相關基因，利用數據庫對差異表達基因的功能進行注釋，參考相關文獻資料，總結前人的研究成果，從所有unigene中篩選出137個可能與花朵開放及花瓣發育的差異表達基因。根據它們的功能特性，137 個差異表達基因被劃分為3 大類，主要涉及植物激素信號轉導、轉錄調控、細胞伸長等調節過程。32 個unigene 與植物激素信號傳導代謝調節通路有關，包括生長素信號轉導通路（Auxin sig?naling pathways），茉莉酸信號轉導通路（Jasmonic acid signaling pathways），細胞分裂素信號轉導通路（Cytokinin signaling pathways），赤霉素信號轉導通路（Gibberellic acid signaling pathways），乙烯信號轉導通路（Ethylene signaling pathways），脫落酸信號轉導通路（Abscisic acid signaling pathways）等（見圖6），其中生長素信號傳導通路所含的差異表達基因數量最多，有14個，其次是乙烯信號傳導通路，含6 個；67 個unigene 與細胞伸長有關，主要包括擴張蛋白（Expansin）、水通道蛋白（Aquaporin）、木葡聚糖內糖基轉移酶/水解酶、木糖酶（Xylosi?dase）、纖維素合成酶（Cellulose synthase）、果膠酯酶（Pectin esterase）、果膠酶（Polygalacturonase）、果膠裂解酶（Pectate lyase）、谷氧還蛋白（Glutaredox?in）、GDSL 脂酶/脂肪酶（GDSL esterase/lipase），其中果膠酯酶所含unigene 的數量最多（見圖7）。而與轉錄調控作用有關的unigene有38個，轉錄因子主 要 有MYB、Zinc finger protein、AP2/EREBP、MADS、bHLH 等5 個類型，其中Zinc finger protein和MYB 轉錄因子所含數量較多，分別有12、11 個（見圖8）。此外，對調控開花網絡中的關鍵基因，如CONSTANS（CO）、FLOWERING LOCUS T（FT）、FLOWERING LOCUS D（FD）、SHORT VEGETA?TIVE PHASE （SVP）、FLOWERING LOCUS C（FLC）、SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1（SOC1）、LEAFYL（LFY）、APETALA 1（AP1）、APETALA 2（AP2）、TERMINAL FLOWER 1（TFL1）、APETALA 3（AP3）、PISTILLATA（PI）、AGAMOUS（AG）、SHATTERPROOF 1（SHP1）、SEPALLATA 3（SEP3）的表達量進行了分析，發現這些基因主要在花瓣發育的早期階段表達，且表達量不高，成花素基因FT 基本不表達；調控花瓣發育的相關基因AP3、PI、SEP3 中度表達，表達變化水平類似（見圖9）；其中只有AG、SHP1為差異表達基因，這兩個基因均是在花瓣發育早期表達，后期不表達，它們可能參與了金花茶花瓣早期發育的調控。

2.4 金花茶花瓣發育過程中差異表達基因的趨勢分析

對1 922 個差異表達基因進行趨勢分析，發現差異表達基因可聚類為20 種基因表達模式，其中1 349 個差異表達基因在profile16、profile19、pro?file18、profile0、profile5等5個基因表達模式中達到了顯著水平（P＜0.05），每個profile 所包含的差異表達基因數量分別為465、345、190、187、162個；此外，基因表達模式Profile19 和Profile0 的變化趨勢相對簡單，Profile19 為持續上調表達，Profile0 為逐步下調表達；其余3個基因表達模式的變化趨勢相對復雜，Profile16、Profile18 為先上調再下調表達模式，但兩者的基因上調表達的時間點以及基因下調表達程度存在差別，而Profile5 為先下調再上調，表達維持穩定一段時間后，再進行下調的基因表達模式（見圖10）。對金花茶花瓣差異表達基因進行趨勢分析，發現差異表達基因存在多種表達模式，表明在金花茶花朵開放以及花瓣發育中存在著復雜的調控機制。結合趨勢分析結果，發現篩選獲得的部分unigene 在金花茶花朵開放及花瓣發育過程中表現為持續上調或下調表達趨勢，它們的變化趨勢與4 個比較組中差異表達基因的變化趨勢基本相符（見圖11）。在植物激素信號傳導、轉錄調控、細胞伸長等3個調節過程中，持續上調或下調表達的unigene 數量分別為9 個、12 個和27 個，且持續上調的unigene 多于下調表達的unigene 數量。在果膠酯酶、鋅指蛋白和生長素信號傳導通路中，含有持續上調的unigene 較多，而持續下調表達的unigene 主要集中在AP2/EREBP轉錄因子、木葡聚糖內糖基轉移酶/水解酶基因家族、茉莉酸信號傳導通路中，這些相關的unigene可能在調控金花茶花瓣的生長發育方面具有重要作用。

2.5 金花茶花瓣中高表達基因功能分析

為研究高表達基因在金花茶花瓣發育過程中的功能，將FPKM 均值大于100 的unigene 認為是高表達基因。在金花茶花瓣轉錄組的unigene中，共有334個高表達的unigene，其中有31個為差異表達基因。對高表達基因進行表達聚類分析，發現這些unigene具有不同的表達方式（見圖12），其中大部分unigene 只在花瓣發育的單個時期高表達，少數unigene 可在花瓣發育的早期（S1）和后期（S5）高表達。對高表達基因進行KEGG功能富集分析，共有7條KEGG 代謝通路的富集達到了極顯著水平（Q<0.05），具體的通路為類黃酮生物合成（ko00941），植物晝夜節律（ko04712），吞噬體（ko04145），苯丙素生物合成（ko00940），核糖體（ko03010），戊糖和葡萄糖醛酸鹽轉化（ko00040），光合生物的固碳作用（ko00710）（見圖13）；此外，20%的高表達unigene富集到了新陳代謝通路途徑（ko01100），雖然該通路的富集程度未到達顯著水平。KEGG富集分析結果發現，金花茶花瓣高表達基因的功能主要與次生物質合成、植物晝夜節律調節有關。

2.6 金花茶差異表達基因的實時熒光定量PCR驗證

為驗證金花茶花瓣轉錄組測序的準確性，將18S rRNA 作為內參基因，隨機選取3 個差異表達基 因Contig18624_g1、TRINITY_DN207944_c2_g1和TRINITY_DN188579_c0_g2 進行實時熒光定量PCR 分析，它們分別被注釋為絲氨酸羧肽酶（Ser?ine carboxypeptidase）、番茄紅素-環化酶（Lycopenecyclase）、木葡聚糖內糖基轉移酶/水解酶（見圖14～16）。RT-qPCR 結果顯示，在金花茶花瓣發育中3 個DEG 表達量的變化趨勢與轉錄組測序中基因的表達量變化趨勢基本符合，即這些unigene 在金花茶花瓣發育早期（S1、S2、S3）中低度表達，在花瓣發育后期（S4、S5）高度表達。金花茶花瓣的熒光定量PCR 數據表明花瓣轉錄組測序數據的可靠性較高。

3 討論

花瓣是高等植物生殖系統的重要組成部分，除了保護雄蕊和雌蕊，花瓣的大小、形狀、顏色和排列等特征，還可以吸引傳粉昆蟲，保證授粉的成功。花瓣生長的基本程序，始于花瓣原基的形成，隨后進入到細胞增殖時期，然后再通過細胞擴展和分化，形成成熟花瓣器官［24］，而花瓣細胞擴展過程中會發生細胞膨壓改變、細胞骨架重構、細胞壁物質降解及重新合成等生理活動［25］。雙子葉植物花瓣的細胞壁主要由木葡聚糖和纖維素構成，并通過結構蛋白進行交聯。花瓣發育過程中，細胞增大依賴于內糖苷酶、糖基轉移酶、水解酶、擴展蛋白和這些酶的共同作用［26］。對金花茶花瓣4 個比較組中差異表達基因的GO 富集分析結果與上述觀點相符，金花茶開花過程中GO 分類表明差異表達基因主要與纖維素代謝，葡聚糖合成與分解，化學鍵生成與斷裂，生物膜的合成以及電子載體活性有關；另外，發現許多對細胞增大有促進作用的水解酶、聚半乳糖醛酸酶、轉移酶都被富集到了GO 分類中，并且達到了顯著水平；其中二級GO 分類單元催化活性（GO：0003824），它所含有的三級GO 分類單元水解酶（GO：0016787）、四級GO 分類單元糖基鍵水解酶（GO：0016798）、五級GO 分類單元水解O-糖基化合物水解酶（GO：0004553）均表現為顯著富集，這些分類單元包含的unigene 以木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶（XTH）為主，該蛋白為多基因家族，在植物細胞生長過程中XTH 是植物細胞壁重構過程中的關鍵酶之一，不但可以松弛和合成細胞壁，還能強化細胞壁；另外還具有降解細胞壁的功能［27～28］。而金花茶花瓣4 個比較組中差異表達基因的KEGG 富集分析，發現差異表達基因主要富集在次生物質代謝、激素合成與傳導、糖類和脂類物質轉化等代謝通路中，而在深山含笑（Michelia maudiae）［29］、薰衣草（Lavandula an?gustifolia）［30］、茶 樹（Camellia sinensis）［31］、菊 花（Chrysanthemum morifolium）［32］等其他植物的花瓣富集分析中，也存在類似的結果。

對金花茶花瓣的差異表達基因進行功能注釋，共獲得10 大類與花瓣發育有關的下游功能基因，其中木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶（XTH）、果膠酯酶（PE）等功能基因所占比例較大，驗證了金花茶花瓣中差異表達基因GO 富集分析的結果。本研究鑒定出了9 個XTH 基因，在金花茶花朵開放過程中，它們的表達變化趨勢存在一定差異，其中4 個XTH unigene 在花朵開放過程中持續上調表達，而另外3個則持續下調。與擬南芥、月季、康乃馨等XTH 基因的表達情況進行比較，發現金花茶XTH 基因的表達量、表達部位與上述植物不盡相同。 如TRINITY_DN185804_c2_g1 被 注 釋 為AtXTH33，主要在金花茶成熟花瓣中高表達，而擬南芥AtXTH33 在花發育中期的花藥中進行表達。Contig15598_g1 和TRINITY_DN193129_c4_g1 這兩個unigene被注釋為AtXTH2，TRINITY_DN20353 9_c1_g3 被注釋為AtXTH3，在金花茶花瓣發育過程中它們持續下調表達，但在玫瑰花中的RbXTH2能被乙烯誘導表達，在花瓣脫落中具有促進細胞分離的功能［33］；在擬南芥中AtXTH3 在絨氈層細胞壁中專一性表達，可降解絨氈層細胞壁［34～36］；而在康乃馨中DcXTH2 和DcXTH3 基因卻在開放的花瓣中大量表達，很可能促進了花瓣的生長發育［37］。根據unigene 表達量的變化情況進行推測，在金花茶花瓣發育過程中表達量趨勢上調的4 個XTH 基因可能起到了正調控作用；而表達量趨勢下調的基因可能具有負調控作用，但其具體功能仍需進一步研究。

研究中還發現，在金花茶花瓣發育過程中，有6條激素轉導通路含有差異表達基因；這些差異表達基因主要分布在生長素信號轉導途徑、乙烯信號轉導途徑、茉莉酸信號轉導途徑等3條植物激素轉導途徑中。生長素在調節植物從胚胎發生到成熟的生長進程中具有決定性作用［38］，而本研究中金花茶花瓣的生長素信號轉導通路含有的差異表達基因數量最多，共有14 條；其中1 條unigene 被注釋為AUX1 共轉運體（AUX1/LAX），6 條unigene被 注 釋 為AUX/IAA 基 因，7 條unigene 被 注 釋 為SAUR 基因，AUX1/LAX 是生長素運入載體，AUX/IAA 和SAUR 基因都屬于生長素早期反應基因，它們對生長素起重要調節作用。此外，還發現注釋為AUX/IAA 和SAUR 的unigene 主要在完全開放的成熟花瓣中高表達，有5 條unigene 的表達量隨花瓣發育持續上調表達，根據參與生長素信號轉導基因的表達量推斷，它們可能在決定和維持花瓣中發揮著積極的作用。該結果與Han 等在月季花瓣發育的轉錄組研究［12］以及花瓣近軸面和遠軸面細胞的轉錄組研究結果類似［39］，月季花瓣發育中生長素信號轉導通路也存在大量高表達的差異表達基因。金花茶花瓣發育過程中，發現乙烯信號轉導途徑也存在較多的差異表達基因；有研究表明，生長素與乙烯可以協同作用，調節根的伸長、葉片發育和許多其他生理過程［40～41］。金花茶花瓣發育過程中是否存在生長素與乙烯協同作用，調節花瓣發育，這個問題還有待進一步研究。

在金花茶花瓣發育的各個階段，表達水平具有較大變化的轉錄因子有MYB、bHLH、AP/EREBP、MADS、Zinc finger protein。MYB 轉錄因子是植物轉錄因子中最豐富的類群，具有調節植物發育、次生代謝物質合成、激素信號轉導、增強植物抗性等作用［42］。本次金花茶花瓣轉錄組分析，也發現了許多MYB 轉錄因子，其中TRINI?TY_DN182693_c0_g1 和TRINITY_DN197357_c2_g 3，這兩個unigene 分別被注釋為AtMYB17 和At?MY105。此前有研究報導，擬南芥AtMYB17 主要在莖尖、幼嫩的花蕾、發育的心皮和纖毛［43］、花分生組織中表達，可使植物從營養生長向生殖生長轉變，起始花原基的生成及促進植物開花［44］；金花茶中TRINITY_DN182693_c0_g1 只在幼嫩的花蕾期（S1）高表達，與擬南芥AtMYB17 在花組織中的表達特征類似，但其是否具有促進植物成花轉變的功能仍有待深入研究。而擬南芥AtMYB105 主要在植物器官的邊緣表達，具有調控側生器官的發育及形成、腋生分生組織發育的功能［45］，與At?MYB105 同源的基因TRINITY_DN197357_c2_g3在金花茶開放的前四個時期中度表達，因此推測該基因對于維持金花茶花瓣的形狀及大小，可能具有重要的調節功能。此外，屬于bHLH轉錄因子的TRINITY_DN194462_c2_g2 和Contig2515_g1，被注釋為AtBPE（BIGPETAL）基因，它們在金花茶花瓣發育的不同階段中低度表達；目前，已有研究表明擬南芥的BPEp 基因主要在花瓣中特異性表達，其突變體的花瓣表面積比野生型更大，該基因可抑制細胞體積擴增來調控花瓣形狀的大小［46］；根據這兩個unigene 的表達量及其同源基因的已知功能，推測它們可能在調控金花茶花瓣大小上具有重要作用。

本研究對金花茶花瓣轉錄組中高表達基因進行表達聚類分析，發現大部分unigene 只在花瓣發育的單個時期高表達，因此推斷這些unigene 主要在特定時期來調控金花茶花瓣的發育；高表達基因KEGG 富集分析結果發現，金花茶花瓣高表達基因主要與次生物質合成有關，該結論與金花茶花瓣中差異表達基因KEGG 富集分析結果類似。這些在花瓣中高表達的基因和差異表達基因可能對金花茶花瓣內次生代謝物質的合成具有調控利用。在金花茶花瓣轉錄組的高表達基因中，有31個為差異表達基因，與花瓣發育有關的unigene 有TRINITY_DN190714_c3_g1、TRINITY_DN210333_c3_g6、TRINITY_DN198980_c0_g7，它們分別被注釋為GDSL 酯酶/脂肪酶、果膠酯酶、果膠裂解酶；另外，高表達基因中與花瓣發育調控的基因主要涉及植物激素信號轉導、轉錄調控、細胞伸長等3個調節過程，與細胞伸長有關的功能基因主要是水通道蛋白（Aquaporin protein，AQP）。植物水通道蛋白是重要的多功能膜蛋白，在物質轉運、種子萌發、蒸騰作用、光合作用、氣孔調節及抗逆應答等過程中起重要作用［47］。目前，Ma 等已研究證實月季的水通道蛋白RhPIP2；在花瓣表皮細胞中高度表達，表達模式與開花周期類似，該蛋白具有促進花瓣細胞擴張，使花瓣伸長的功能［48］。綜合水孔通道蛋白在金花茶花瓣中的高表達量及其同源基因的已知功能，推測水孔通道蛋白，特別是被注釋為PIP 類型水通道蛋白的unigene（TRINI?TY_DN208396_c4_g1），可能在調控金花茶花瓣形狀上具有重要作用。

植物開花是營養生長向生殖生長變化的過程，主要分為成花決定、花的發端、花器官發育等3個階段［49］，由開花調控相關基因CO、FT、SOC1、LFY、AG、TFL1、SEP3、AP1 等組成調控網絡，進行精細的控制［50-52］；花器官發育的ABCDE 模型中，主要由A類基因（AP1）、B類基因（PI，AP3）、E類基因（SEP）調控花瓣的形成［53］，當這些基因發生突變時，會導致花瓣的錯位發育［54］。本次實驗選取了花瓣原基形成后不斷伸長的花瓣作為研究對象，對調控花瓣形成相關基因的表達量進行了分析，發現金花茶的PI、AP3、SEP 基因表達水平相似，而B 類基因AP3、PI 結合為異源二聚體后，才能和SEP/AP1 形成四聚體決定花瓣的發育［55］，因此推測蛋白之間的互作，使PI、AP3、SEP 等基因的表達水平類似。模式植物的研究表明，調控花器官發育的MADS-box 基因的功能與其表達模式高度相關，所以在非模式植物中，可以利用MADS-box 基因表達模式對它們的功能來進行預測［56］。此外，Sablowski等發現AP3/PI的異源二聚體可以直接調節NAP（NAC-LIKE，ACTIVATED BY AP3/PI）基因，而NAP 在花發育中的花瓣和雄蕊中表達，其表達與花瓣和雄蕊組織由細胞分裂到細胞膨大的轉變有關［57］；劉志雄等對大花惠蘭（Cymbidium faberi Rolfe）CyfaPI 基因功能研究，發現轉化35S：：Cyfa?PI 的擬南芥中，PI/pi-1 雜合子背景下的轉基因擬南芥的一個株系產生了較大的花［58］，上述研究表明B類基因，如PI、AP3，對于花型及花瓣大小的調控可能起到重要的作用。金花茶的AP1、PI、AP3、SEP 基因都屬于MADS-box 轉錄因子，在金花茶花瓣發育過程中基因PI、AP3、SEP 的表達趨勢類似，它們主要在花瓣發育的早期和中期中度表達，在盛開的花瓣（S5）中不表達，因此它們可能參與了金花茶花瓣早中期發育的調控，但它們具體的調控機制仍有待揭示。

4 結論

本研究利用RNA-seq 技術分析了金花茶花瓣發育過程中轉錄組的動態變化GO 富集分析發現，金花茶開花過程中差異表達基因的功能主要與糖的合成、分解與代謝、酶的活性與催化、化學鍵的生成與斷裂、生物膜的合成以及電子載體活性有關。KEGG富集分析結果表明，金花茶花瓣差異表達基因的功能則主要與次生物質代謝、激素合成與傳導、糖類和脂類物質轉化有關。金花茶花瓣差異表達基因涉及6條激素信號轉導通路，其中生長素轉導途徑所含差異表達基因數量最多，部分AUX1/LAX 共轉運體、AUX/IAA 基因、SAUR 等生長素應答基因在開花過程中明顯上調，表明生長素可能對于調控金花茶花瓣發育具有重要的作用；部分轉錄因子及下游功能基因MYB、bHLH、鋅指蛋白、木葡聚糖內糖基轉移酶/水解酶、果膠酯酶、果膠裂解酶等，它們的表達量呈現顯著變化，其中XTH 顯著富集于GO分類中的水解酶活性，因此推斷這些基因可能在金花茶花瓣發育過程中具有重要的調控作用。此外，本研究分析了FT、SOC1、AP3、PI、SEP3 等開花調控關鍵基因在金花茶花瓣發育過程中主要以中低表達為主。KEGG 富集分析結果表明，金花茶花瓣高表達基因主要與次生物質合成有關。這些結果為進一步研究金花茶花瓣發育的調控機制奠定了理論基礎。