暴馬丁香成熟胚愈傷組織和體胚誘導及其生理狀態解析

彭春雪 崔雪梅 沈海龍

（東北林業大學林學院，林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040）

暴馬丁香（Syringa reticulata var.mandshurica）是木犀科（Oleaceae）丁香屬（Syringa）多年生灌木或小喬木，分布于我國東北、華北和西北等地。暴馬丁香花香濃郁，花期長，不僅可以作為城市綠化樹種，還可以制作花茶以及提煉精油等［1］。此外，其樹干、樹皮和枝條中均含有較高的紫丁香苷和橄欖苦苷，具有多種藥理活性，可調節免疫力、抗炎、抗菌和降血壓等［2～3］。但暴馬丁香天然資源數量有限，分布散；而且近年來藥廠大量收購暴馬丁香樹皮，野生資源破壞嚴重［4］。因此，規模化發展人工資源，已經成為暴馬丁香開發利用的重點，而開發適宜的優良種質規模化繁殖技術是人工林資源發展的首要問題。體細胞胚胎發生技術（簡稱“體胚發生”）是目前被認為最具有潛力的規模化快速繁殖技術，它不僅為植物育種提供新的途徑，還可以為遺傳轉化提供理想材料、為研究植物發育提供理想模型等［5］。

目前，在暴馬丁香種子繁殖、扦插和嫁接繁殖、組織培養莖芽發生繁殖等方面已經取得了一些成果［1］，以未成熟胚為外植體的體胚發生體系也成功建立［6］。雖然，暴馬丁香再生植株已成功獲得，但依然存在一些制約暴馬丁香體胚高頻發生的問題。前期研究中發現，以未成熟胚為外植體雖獲得體胚，但體胚發生過程中伴隨外植體褐化現象，且外植體褐化顯著影響體胚的發生率［6］。此外，以未成熟胚作為外植體，存在種子易受采集時間限制、不易保存、進行大量研究受限制等問題［7］。這些現象阻礙體胚發生技術規模化應用，且至今尚未得到解決。因此，選擇合適的外植體對愈傷組織誘導和體胚發生都至關重要，同時針對愈傷組織誘導和體胚發生過程中的生理變化的研究對了解影響體胚發生的生理響應機制具有重要的意義。

為了進一步建立體胚發生能力與外植體內部的生理生化代謝之間的聯系，了解體胚發生的機理。我們以暴馬丁香成熟胚為外植體對愈傷組織誘導和體胚發生進行探索，并對愈傷組織和體胚誘導過程中外植體生理變化狀態進行測定分析，以期揭示愈傷組織誘導的潛在能力，為進一步建立愈傷組織誘導和體胚發生能力與生化代謝間的關系提供依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料滅菌

首先，將暴馬丁香種子去翅后清洗15 min，蒸餾水浸泡2 d。在超凈工作臺內用75%酒精浸泡30 s，5%NaClO 浸泡15 min 進行消毒處理，最后用無菌蒸餾水清洗6～7次后備用。

1.2 基礎培養基和培養條件

本次研究使用含有70 g·L-1蔗糖，0.4 g·L-1酸水解酪蛋白，6.5 g·L-1瓊脂的MS1/2（MS 培養基中所有成分均減半）為基本培養基。在高溫高壓滅菌之前，將培養基的pH 調至5.8。對所有實驗，將培養物保持在（25±2）℃的黑暗條件中。

1.3 愈傷組織和體胚誘導

將滅菌后的種子胚軸端切除2～3 mm，擠出胚，將兩片子葉轉移至含有不同濃度NAA（0、2、3、4、5、6 mg·mL-1）和BA（0、0.5、1、2、3 mg·mL-1）組合的培養基中進行愈傷組織和體胚誘導。每個培養皿中接種10 個外植體，每個處理重復10 次。在培養過程利用體視顯微鏡對外植體進行觀察，記載外植體變化狀態、愈傷組織誘導和體胚發生情況。

1.4 生理指標測定

篩選確定0.5 mg·mL-1BA+5 mg·mL-1NAA 的組合為最佳組合，將外植體接種至含該植物生長劑組合的培養基中進行愈傷組織和體胚誘導，在培養期間對0、3、7、15、30、45和60 d的外植體取樣進行生理生化分析。

測定方法：多酚含量根據Sabooni 等人的方法測定［8］；多酚氧化酶（PPO）活性按照Jariteh［9］的方法測定；過氧化物酶（POD）活性采用愈創木酚法、參 照Chai 等 的 方 法 測 定［10］；超 氧 化 物 歧 化 酶（SOD）活性采用氮藍四唑光化還原法來測定［11］；丙二醛（MDA）含量以脂質過氧化水平方法測定［12］；苯丙氨酸裂解酶（PAL）活性參照Eldin 等人［13］的方法測定。

1.5 數據分析

培養60 d 后統計愈傷組織誘導率和體胚發生率，公式如下：

試驗數據用Microsoft Office Excel 2007進行統計處理，利用SPSS Statistics 19.0 對所有數據進行方差分析，并使用Duncan 多范圍檢驗以5%的概率進行均值比較，最后用Sigmaplot 12.5繪圖。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織和體胚的形成

子葉接種3 d 后開始膨大，葉片邊緣形成卷曲，7 d 培養后子葉表皮出現白色凸起，繼續培養15 d后，可見外植體邊緣出現白色透明的愈傷組織（見圖1A），30 d后少數外植體的邊緣上出現早期體胚，60 d后早期體胚發育成子葉型胚（見圖1B）。

2.2 不同生長調節劑對愈傷組織誘導的影響

暴馬丁香成熟胚接種于含不同濃度的生長調節劑組合的培養基上均能誘導出愈傷組織，但不同濃度的生長調節劑組合對愈傷組織誘導狀況有顯著的差異（P＜0.05）。其中，BA 不存在時，依然有愈傷組織的產生，并隨著NAA 濃度的升高呈先增加后降低的趨勢，在5 mg·mL-1NAA 處理下愈傷組織誘導率最高（78%），在2～3 mg·mL-1NAA 處理下，愈傷組織誘導率最低（34%），與對照組（34%）相比無差異；當NAA 不存在時，2 mg·mL-1BA 處理下，愈傷組織誘導率最高（100%），在1 mg·mL-1BA處理下愈傷組織誘導率最低（68%），與對照組（34%）相比提高50%。在BA 和NAA 同時存在的組合均能誘導愈傷組織，其中3 mg·mL-1BA 和2 mg·mL-1NAA 組合的誘導率最低（60%），但仍高出對照43%，1 mg·mL-1BA 和5 或6 mg·mL-1NAA 的組合愈傷組織誘導率均達100%（見圖2）。

2.3 不同生長調節劑對體胚發生的影響

暴馬丁香體胚可以從外植體上直接形成，沒有經過愈傷組織階段，但體胚發生率相對較低。不同濃度的生長調節劑組合對暴馬丁香體胚發生均有極顯著的影響（P＜0.01）。在不加任何生長調節劑或單獨添加1種生長調節劑的培養基上，均無體胚發生。在生長調節劑組合為3 mg·mL-1BA+2 mg·mL-1NAA、1 mg·mL-1BA+4 mg·mL-1NAA、2 mg·mL-1BA+4 mg·mL-1NAA、0.5 mg·mL-1BA+5 mg·mL-1NAA 和2 mg·mL-1BA+6 mg·mL-1NAA 的培養基上有體胚形成。其中，在0.5 mg·mL-1BA+5 mg·mL-1NAA 處理組合中體胚發生率最高為8%，其余處理體胚發生率均為2%（見圖2）。

2.4 愈傷組織誘導過程中多酚含量和PPO 活性的變化

在暴馬丁香愈傷組織誘導過程中，細胞內的多酚含量和PPO 活性發生顯著的變化（P＜0.05）。多酚含量在培養過程中呈升—降—升—降趨勢，而PPO 活性變化趨勢與多酚含量變化趨勢完全相反呈降—升—降—升趨勢。其中，多酚含量在培養第7 d 時含量最低（0.14%），在第15 d 時達到積累峰值（0.34%）。PPO 活性在培養第3 d 時活性最低（31.66 μ·g-1FW·min-1），在第7 d 時PPO 活性達到積累高峰（175.66μ·g-1FW·min-1）。隨著培養時間延長，PPO 活性呈下降趨勢，在培養至30 d 下降至33.1μ·g-1FW·min-1，隨后繼續升高（見圖3）。

2.5 愈傷組織誘導過程中抗氧化酶（SOD 和POD）活性的變化

在暴馬丁香愈傷組織誘導過程中，細胞內SOD 活性發生顯著變化（P＜0.05）。SOD 活性隨著培養時間的延長呈降—升—降趨勢，在培養0～3 d 時外植體細胞內的SOD 活性急劇下降，在第3 d 時SOD 活性降至最低為988.89 μ·g-1FW。隨后SOD 活性逐漸上升，培養15 d 時SOD 活性達到峰值（1 618μ·g-1FW），隨著培養時間的延長，SOD活性又開始下降。此外，外植體在誘導過程中的POD 活性隨培養時間的延長呈直線上升，在培養初期，POD 活性最低，為1 126.6 μ·g-1FW·min-1。當培養至60 d時，POD 活性相較于0 d時的POD 活性增加了90倍（見圖4）。

2.6 愈傷組織誘導過程中MDA 含量和PAL 活性的變化

在暴馬丁香愈傷組織誘導過程中，MDA 活性隨著培養時間的延長發生顯著變化（P＜0.05）。在外植體培養過程中，細胞內MDA含量均低于0 d（27.41μ·g-1FW）。其中，在培養7 d 時，外植體細胞內MDA 活性最高（23 μ·g-1FW），與0 d 相比下降了16%；在培養30 d 時，MDA 含量最低（10.14μ·g-1FW），與0 d相比下降了63%（見圖4）。此外，在培養過程中，外植體細胞內PAL 活性也發生顯著變化（P＜0.05），培養3 d（3 460.85μ·g-1FW·h-1）時細胞內PAL 活性最低，培養至60 d 時細胞內PAL 活性積累達到峰值，相較于0 d（4 514.55μ·g-1FW·h-1）細胞內PAL活性提高了52%（見圖4）。

3 討論

3.1 不同植物生長調節劑對愈傷組織誘導和體胚發生的影響

體外培養條件中，細胞分裂素和生長素對植物組織或者器官的愈傷組織誘導反應起到至關重要的作用，通過控制生長素與細胞分裂素的比例進行愈傷組織誘導已經在很多植物中獲得了成功，但不同植物或同種植物不同器官所需的植物生長調節劑物質種類也大不相同［14］。在本研究中，以暴馬丁香成熟胚為外植體，在0.5 mg·mL-1BA 和0～6 mg·mL-1NAA 處理組合下愈傷組織誘導率高達90%以上，而在劉春蘋等研究中［7］，以暴馬丁香未成熟胚為外植體，在0.5 mg·mL-1BA 和1.5 mg·mL-1NAA處理組合中，獲得最大愈傷組織誘導率（84%）。我們發現，相較于未成熟胚，成熟胚具有更高的愈傷組織誘導率。同時，在成熟胚研究中發現通過愈傷組織的間接體胚發生誘導率為0%，而在未成熟胚研究中，通過愈傷組織的間接體胚發生誘導率為24%［7］，這表明成熟胚作為外植體雖獲得較高的愈傷組織誘導率，但這些愈傷組織無體胚發生能力，其原因可能是外植體暴露于高水平生長調節劑環境中，細胞可能僅僅是模擬胚胎發生的細胞行為，并未真正轉化為胚胎發生細胞，無法進一步形成體胚［15］。此外，在我們的研究中發現以成熟胚為外植體，在0.5 mg·mL-1BA 和5 mg·mL-1NAA 處理組合中獲得最高體胚誘導率（8%），其中體胚發生形式均為直接發生。而未成熟胚研究中，在0.5 mg·mL-1BA 和0 mg·mL-1NAA處理組合中，以直接體胚發生形式的體胚誘導率為36%。相較于成熟胚，未成熟胚作為外植體無論是直接體胚發生還是間接體胚發生均更容易獲得體胚。在番木瓜［16］和長白落葉松［17～18］研究中也出現類似結果。同時，在未成熟胚中誘導愈傷組織只需要較低濃度的NAA［7］，但在成熟胚中則需要較高濃度的NAA，這表明愈傷組織誘導受到外植體的生長發育狀態的顯著影響。植物幼嫩、生長旺盛的部位生長素類激素水平較高，只需要較低濃度的外源激素。而植物發育成熟且分化程度較高的部位，內源激素較低，脫分化困難，因此需要補充較高濃度的外源激素［19］。有趣的是，對于高百分比的愈傷組織誘導，本研究發現NAA 的添加并沒有起到主導作用。與之相反，BA 對于愈傷組織誘導卻是必需的且比NAA更有效。這在紅景天愈傷組織誘導研究中也得到類似報道［4］。在單獨添加BA 或者NAA 與BA 的處理組合中，有助于愈傷組織形成。有研究指出，BA 對誘導具有優越性，可能是因為植物組織比人工生長調節劑具有更容易代謝天然激素的能力，也可能是因為BA 激發植物組織產生天然玉米素等其他激素的能力［20］。

3.2 愈傷組織誘導和體胚發生過程中外植體的生理變化

本研究中多酚含量在愈傷組織形成初期急劇上升，隨著培養時間的延長緩慢下降，但仍然保持較高水平。在以往的研究中，酚類物質通常被視為體外繁殖的有害化合物［21］，但近年來越來越多的研究表明酚具有促進體外形態發生的能力，在根的形成以及枝條增殖中均具有促進作用［22］。在咖啡愈傷組織研究中，觀察到愈傷組織僅發生在褐變的外植體上［23］。眾所周知，愈傷組織細胞是高代謝和活躍分裂的細胞，一旦形成愈傷組織，就會繼續增殖，而愈傷組織增殖則需要生長素［24］。Eldin 等研究指出，許多酚類化合物可能通過酶促反應提高或者降低吲哚乙酸（IAA）的含量進行生理調節［13］，這就解釋了暴馬丁香在愈傷組織形成初期具有較高水平多酚含量的現象。除此之外，本研究中發現，在暴馬丁香子葉型胚發生階段，PAL 活性急劇升高，這與Khan 等在水飛薊素體胚研究結果類似［25］。有研究指出，PAL 參與的代謝途徑產生的酚酸化合物一部分可以充當木質素生物合成的前體，一部分則具有生長素保護劑的功能［26］。這些研究表明體外培養過程中體胚誘導和酚類化合物的產生并不矛盾，其中的某些酚類化合物可能參與木質素的合成，這在體胚發生過程中是極其重要的。在體胚誘導過程，本研究發現POD 活性逐漸增加，在子葉型胚時期達到峰值，相比之下，SOD 活性體胚發生期間略有下降。這與Blazquez 等在藏紅花體胚發生研究中的結果類似［27］。已有研究證明，POD 和CAT 在生長分化中起到至關重要的作用，其高活性可能與植物芽和根的分化過程相關。同時，Corfeeener 等提出POD活性不僅在體胚發生過程中起到維持細胞的大小和形狀的作用，而且在木質素形成過程中也可能起到維持細胞壁形成的重要作用［28］。此外，研究結果表明暴馬丁香在愈傷組織形成初期SOD 活性有所上升。在夏凱莉的研究中發現黑莓胚性愈傷組織中的SOD 活性顯著高于非胚性愈傷組織［29］，這表明在愈傷組織形成初期需要大量的能量，從而導致產生高的線粒體活性以及過氧化物。因此，通過對POD 和SOD 活性變化的觀測可以對體外培養過程的形態變化提供理論依據。

綜上所述，我們得出在0.5 mg·mL-1BA 和0～6 mg·mL-1NAA 處理組合下愈傷組織誘導率高達90%以上，在0.5 mg·mL-1BA 和5mg·mL-1NAA 處理組合中獲得最高體胚誘導率（8%），其中，體胚發生形式均為直接發生。而在高百分比的愈傷組織誘導中，發現NAA的添加并沒有起到主導作用，相反BA 對于愈傷組織誘導卻是必需的且比NAA更有效。此外，在生理研究中多酚含量在愈傷組織形成初期急劇上升，隨著培養時間的延長緩慢下降，但依舊保持較高水平；POD 活性逐漸增加，在子葉型胚時期達到峰值；相比之下，SOD 活性體胚發生期間略有下降。這表明外植體中適量的多酚含量積累和較高POD 活性有利于愈傷組織誘導和體胚發生。因此，在未來的研究中，需要進一步探究活性多酚和氧代謝與愈傷組織誘導和體胚發生之間的調控機理。