微流控芯片在農產品安全檢測中的應用

王東鵬，葉 誠，廖小麗

（武漢海關技術中心，武漢 430050）

0 引言

“民以食為天，食以安為先”，隨著食品工業在全球工業生產力的推動下發展規模迅速擴大，國內外的食品安全事件也頻繁發生，北美新鮮菠菜和胡蘆巴芽急性大腸桿菌感染，導致多數感染者出現腎功能衰竭甚至死亡[1-2]，食品安全不僅危害人類身體健康，對國家經濟也造成了巨大損失，據世界衛生組織報道，2011年大腸桿菌O104:H4爆發對德國經濟造成近13億美元的損失[3]。食品安全已成為全球公共衛生話題[4-5]。

食品安全涉及食品的生產、加工、儲存和運輸等環節，有效解決食品安全問題需要對上述過程進行全面監控，任一過程疏忽都可能引發重大食品安全事故。食品安全檢測與分析是監督食品安全和控制食品污染的重要手段，由于食品種類多樣、組分復雜和雜質繁多，對食品中有害物質、非法添加劑和殘留物等高效快速、準確可靠的現場檢測成為當下分析的主要難點之一[6-7]。傳統的食品安全檢測技術常基于儀器分析，如核磁共振、紅外光譜、原子吸收光譜法、熒光光譜法、免疫色譜法[8-9]、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、液相色譜-質譜法(LC-MS)和氣相色譜-質譜法(GC-MS)[10-11]等，這些技術雖具有高靈敏度、高分離效率、適用范圍廣和定性定量準確度高等優點[12]，但仍具有一定的局限性，如需要昂貴的大型儀器、樣本前處理復雜且周期較長、試劑的消耗多，同時需要專業技術人員進行檢測分析，因此迫切需要研制出可以滿足現場、實時快速、高效便攜和可在線檢測食品的技術和方法[7]。

微流控芯片，又稱為芯片實驗室(Lab-on-a-chip)，是依靠表面張力、流體阻力、能量耗散等一系列特殊效果來控制流體流向、縮短反應時間的微型實驗室[7,13-14]。微流控芯片將分析化學、材料學、電子科學、機械科學、分子生物學和醫學等領域涉及的樣品前處理、分離和檢測等過程集成到小型芯片上，有利于實現樣品前處理和檢測分析的自動化、集成化、小型化、低消耗、高效率和便攜化[7,15-16]。與傳統方法相比，微流控技術滿足了現場、實時檢測的需求，且一定程度克服了培養時間長、前處理復雜的缺點，其具有的小型化、高通量、快速、集成化和消耗少等優點，已被各領域科學家充分利用[17-18]。因此，綜合分析微流控芯片在農產品安全檢測中的應用對農業發展和消費者安全具有一定的指導意義。

1 微流控芯片在農產品安全檢測中的應用

1.1 食品成分檢測

微流控芯片因具有低成本、高靈敏度、微量在線檢測和高效便攜等優點[19]，已成功應用于水果、飲料、茶葉、啤酒和食鹽成分的檢測。智能手機與微流控芯片結合，實現了同時對圖片信息采集、識別和分析，可以簡捷、快速、在線檢測水果中葡萄糖、果糖和維生素C的含量，對葡萄糖的檢測限為1.0 mmol/L[20-21]。紙基微流控芯片-電流法也可用于葡萄糖的檢測，它將葡萄糖氧化酶固定在纖維基紙盤上，利用二茂鐵羧酸作為葡萄糖催化氧化的調節劑，形成電流型葡萄糖生物傳感器。由于紙盤具有良好的親水性，有利于維持葡萄糖氧化酶的催化活性。該傳感器已成功應用于不同蘇打飲料中葡萄糖的測定，檢測限為0.18 mmol/L，結果與HPLC法接近[22]。基于紙基微流控芯片動力學匹配法快速測定茶葉中總多酚(total polyphenol content，TPC)含量，結果表明，該裝置可在10 min內完成現場檢測，在10～100 mg/L范圍內呈現良好的線性關系(r＞0.9955)，與傳統的福林-西奧卡特法(folin-ciocalteu，FC)相比，它的檢測結果與FC法相當，但樣品和試劑消耗量減少了2～3個數量級。紙基微流控芯片動力學匹配法特別適用于茶葉生產過程中TPC變化的在線監測[23]。

啤酒是世界上僅次于水和茶之后的第三大常用飲料[24]，啤酒中乙醇含量常用來評價啤酒的真實性。基于普通辦公用紙研制的乙醇檢測裝置，通過優化pH、酶、濃度及工作電位等參數后，檢測4種不同類型啤酒（Pilsner、Weiss、Lager、和無醇啤酒）中乙醇含量，結果表明乙醇檢測限為0.52 mmol/L，定量限為10 mmol/L[25]。

紙基微流控芯片還可用于其他成分的檢測，如3D紙基微流控芯片測定抗壞血酸，通過不同方法固定試劑于器件，可以有效地避免試劑間相互影響[26]。基于棉滌線進樣通道、過濾區、檢測區和“開關元件”開發的新型3D紙基微流控芯片，可用于食鹽中碘酸根離子(IO3-)的在線過濾和測定，IO3-在5～250 μmol/L范圍內呈線性關系，檢測限為2.3 μmol/L[26]。此外，基于直鏈淀粉和碘的顏色反應制作的紙基微流控芯片可現場測定水稻中直鏈淀粉含量[27]。

1.2 農藥殘留檢測

食源性疾病作為一類常見疾病，是全球需要積極應對的重要話題[28]，中國作為農業大國，農藥使用相當廣泛。農藥在防治蟲害、提高農作物產量方面發揮著不可忽視的作用[29]。然而近年來中國食源性農藥中毒發病人數卻逐年增多[30-31]。因此，研制高效、便捷、實時測定農藥殘留的檢測技術在保證消費者健康安全方面尤為重要[32]。目前微流控芯片技術已成功應用于水樣、蔬菜、水果中有機磷農藥殘留物的檢測。

有機磷農藥因能抑制乙酰膽堿酯酶(acetyl cholinesterase，AChE)，使乙酰膽堿積聚而引發急性毒性[33]，基于乙酰膽堿酯酶抑制而研制的有機磷農藥庫侖檢測微流控芯片，適用于多種蔬菜中有機磷農藥的微量檢測，該裝置因成本低廉、靈敏度高、操作簡單、便攜快捷等優點受到廣泛關注。庫侖微流控芯片檢測馬拉硫磷在10-6～10-3mol/L范圍內具有良好的線性關系，檢測限為412 nmol/L[34]。由于有機磷農藥種類多樣且具有多種毒性，很難測定混合農藥的總濃度，并且以酶為基礎的生物傳感器與不同的傳導機制結合，如光學法[35-36]、比色分析法[37-38]，AChE固定方法通常基于物理或化學吸附和共價結合，這可能導致酶分布不均、酶穩定性降低或酶活性變性[39]。值得注意的是，具有3D結構的量子點氣凝膠結合微流控芯片制成的新型微流體陣列傳感器，可實現對混合農藥總濃度的測定，它不僅可以增加酶的穩定性和活性，還能夠通過熒光強度變化可視化檢測殘留物。通過對對氧磷、對硫磷（巴拉松）、敵敵畏和溴氰菊酯4種農藥檢測，結果表明，對氧磷、巴拉松、敵敵畏和溴氰菊酯的檢測限分別為1.2、0.94、11.7、0.38 pmol/L，檢測范圍為10-5～10-12mol/L，該裝置靈敏度高，檢測范圍廣，可用于水果農藥殘留物的分析[40]。自制的紙基微流控芯片也可檢測河水、黃瓜汁和番茄汁中的對硫磷，檢測限為9.14×10-8g/mL[41]。蔬菜中敵敵畏的檢測可以采用發光氨-H2O2化學發光體微流控芯片，它對敵敵畏的檢測限為3.6 ng/mL，敵敵畏在10～1000 ng/mL范圍內呈現良好的線性關系，并且水溶性金屬離子和水溶性維生素不干擾實際樣品中0.1 μg/mL敵敵畏的測定。該方法無需對樣品進行復雜的前處理，目前已成功應用于白菜、黃瓜和番茄中痕量敵敵畏的檢測，優于HPLC法[42]。具有激光誘導熒光(laser induced fluorescence，LIF)檢測的微流控芯片電泳技術，使用一次性環烯烴共聚物微流控芯片和低成本的LIF檢測器最大限度降低了分析成本，且操作簡單，樣本無需濃縮即可檢測，可快速靈敏地分析草甘膦和草銨膦殘留物，草甘膦和草銨膦的回收率分別為84.0%～101.0%和90.0%～103.0%，檢測限分別為0.05 g/L和0.02 g/L。該裝置分析速度快、具有優異的干擾耐受性，已應用于黃河水、西蘭花和大豆樣品中有機磷酸酯類的現場快速篩查[43]。與LIF檢測器原理（光學原理）相似，根據光的吸收反射原理提出的紙基微流控芯片光電檢測法表明，檢測分辨率為0.002 mg/L，檢測限為0.05 mg/L，檢測結果與便攜式農藥檢測儀檢測限接近，但優于速測卡法。在試劑消耗上分別是農藥檢測儀及農藥速測卡的5.21%與41.7%，且檢測時間縮短了23%[44]。

有機溶劑萃取結合溶劑蒸發微流控芯片技術的出現減少了樣品檢測過程中假陰性結果，同時也消除了溶劑對AchE檢測的影響。生菜樣品中辛硫磷、西維因、蟲螨威、甲胺磷的回收率在75.2%～111.7%之間，與超高效液相色譜-質譜法回收率相當。有趣的是，該方法還能從極稀樣品（如地表水或果汁）中直接預富集農藥，對濃度較低的樣本進行定性和半定量分析[45]。施杰[41]利用自制的紙基微流控芯片檢測河水、黃瓜汁和番茄汁中的西維因，結果表明，西維因的檢測限為3×10-9g/mL，回收率為92.3%～115%，95.7%～111%，94.5%～110%，比有機溶劑萃取結合溶劑蒸發微流控芯片技術的回收率高。

1.3 獸藥殘留檢測

與農藥相似，鑒于獸藥的廣譜性和共通性，獸藥在獸醫學中常用于治療泌尿系統和消化系統疾病[46]。然而，獸藥的大量使用導致肉類食品中出現獸藥殘留，肉類食品中的獸藥殘留又會通過食物鏈進入人體，對消費者的身體健康造成不利影響（急性中毒、慢性中毒、過敏和致癌等）[47]。因此，開發高效便捷的技術檢測肉類食品中的獸藥殘留至關重要。基于微流控芯片-電化學檢測技術分析牛肉中4種四環素類抗生素，在微粒體通道中完成抗生素的預濃縮、分離和電化學檢測，通過優化緩沖液濃度、進樣時間、SDS濃度和分離電壓，抗生素在150 s內分離，土霉素、四環素、金霉素和多西環素檢測限分別為 1.5、4.3、1.9、2.1 nmol/L，與HPLC（回收率為70%左右）法相比，該裝置回收率在80%～93%之間，優于HPLC法。與傳統的膠束毛細管電泳電化學檢測法(micellarelectrokinetic chromatography-electrochemical detection，MEKC-ED)相比，微流控芯片-電化學檢測靈敏度提高了約10900倍，有利于牲畜產品中獸藥殘留的檢測分析[46]。

微流控芯片結合三重四極桿質譜在線同時檢測雞肉樣品中喹諾酮類和金剛烷胺。結果表明，樣品在1～200 ng/mL(R2＞0.992)呈現良好的線性關系，檢測限為0.018～0.043 g/kg，回收率在85.2%～122%之間。與傳統的LC-MS（分析時間為1～4 h）法相比，樣品無需額外的預處理步驟，在微流控芯片上即可完成過濾、預濃縮、洗滌、洗脫和檢測，整個分析時間小于30 min，同時有機試劑消耗減少了約50～100倍。此方法可同時分析多種藥物，樣品和試劑消耗少，顯著縮短分析時間，已成功應用于雞肉樣品中諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、恩諾沙星、環丙沙星、沙氟沙星、達氟沙星和金剛烷胺的在線同時測定[48]。同樣的，微流控芯片與質譜結合也可用于牛奶樣品中諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、恩諾沙星、環丙沙星、依諾沙星的檢測，它集樣品提取、免疫親和富集、磁分離和在線洗脫于一體同時進行。結果表明，線性范圍為0.2/0.5～10 ng/mL(R2＞0.991)，檢測限為0.047～0.490 ng/mL[49]。

1.4 食品添加劑檢測

食用色素常用于增強食品的鮮亮程度[50]，然而食用色素殘留物對公共衛生有害，如辣椒粉中的蘇丹紅。蘇丹紅是一種工業染料，是辣椒粉、果醬和嬰兒食品中的非法添加劑，具有致癌性，嚴重危害人類健康[51-52]。因此，對于快速、靈敏的鑒定蘇丹化合物的技術需求越來越大。檢測蘇丹紅的常用方法是酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和HPLC法，大多數ELISA試劑需要數小時才能產生結果，并且HPLC儀器昂貴且耗時。盡管微流控免疫分析可以縮短多步分析中某一步驟的分析時間，但總分析過程仍然很耗時。然而真空加速微流控免疫分析(vacuum-accelerated microfluidic immunoassay，VAMI)利用抗原-抗體識別原理，將兩層芯片中的濾膜形成的微流控免疫反應器置于在與泵相連的真空室中，以加速免疫測定。抗原與抗體反應可在芯片中形成熒光方塊，與常規微流控免疫分析時間(60 min)相比，VAMI可將時間縮短至15 min，還可以提高靈敏度、操作簡單、試劑消耗少（只需要幾微升試劑和樣品）。利用此裝置檢測蘇丹紅，檢測范圍為0.6～600 ng/mL，相比于HPLC(9 ng/mL)和 ELISA(1.7 ng/mL)的檢測限，VAMI檢測限可低至1 ng/mL。此外，由于VAMI可以通過小型化設備輕松放大以進行高通量檢測，因此更適用于抗原-抗體識別的現場檢測[53]。值得注意的是，由金納米棒(gold nanorods，GNR)和單-6-硫代-環糊精(mono-6-thio-cyclodextrin，HS-β-CD)組成的功能化濾紙芯片，不僅可以對食品中添加的蘇丹紅進行檢測，還可以通過簡單的操作有效地從非法摻假的龍血竭（中藥名，劍葉龍血樹的樹脂）樣品中收集蘇丹染料。該裝置中GNR可有效增強表面增強拉曼光譜(surface enhanced raman spectroscopy，SERS)，此外，CD-GNR通過靜電吸附和氫鍵均勻地組裝在濾紙纖維素上，因此CDGNR紙基對蘇丹III(0.1 μmol/L)的測定表現出更高的靈敏度，蘇丹III和蘇丹IV的檢測限分別為0.1 μmol/L和0.5 μmol/L[54]。

與蘇丹紅類似，硝酸鹽或亞硝酸鹽由于可以增強鹵肉等熟食色澤，同時作為防腐劑而廣泛應用于食品加工生產過程。過量添加硝酸鹽或亞硝酸鹽可能是導致食物中毒的主要原因[55]。基于紙上過氯乙烯樹脂選擇性通過亞硝酸根離子并結合微流控芯片制成的紙基過氯乙烯樹脂微流控芯片已成功應用于水樣和食品中亞硝酸鹽的測定，結果表明，亞硝酸根離子線性范圍和檢測限分別為70～1500 μmol/L和48 μmol/L，檢測限低于HPLC法[56]。基于“開關元件”控制每步反應時間并利用棉滌線作為進樣通道研制的3D紙基微流控芯片，也可以測定水分中的亞硝酸根離子，結果表明亞硝酸根離子濃度在10～400 μmol/L范圍內線性關系良好[26]。此外，亞硝酸鹽還可采用3D紙基微流控芯片結合比色法檢測，此法在三維紙芯片的不同層上固定了亞硝酸鹽檢測試劑，可以實現亞硝酸鹽的快速定量檢測，在0～10 mg/L的濃度范圍內具有良好的線性關系(R2=0.9920)，最低檢測限為2 mg/L，加標回收率為91.4%～102.0%。亞硝酸鹽紙芯片簡單易用、穩定可靠、成本低、耗樣量少、靈敏度高，能快速實現亞硝酸鹽的檢測[57]。基于新型印刷電路板開發的比色分析微流控芯片，可對樣品自動分析，無需使用注射器、泵或閥門等，展現出高靈敏度、便攜化、微型化和低成本的優點。結果表明，亞硝酸鹽的檢測限為5 μg/L，回收率在93.5%～107.0%之間，該裝置已成功應用于火腿、卷心菜、芹菜、橙子和豆腐中亞硝酸鹽的檢測[58]。

與硝酸鹽或亞硝酸鹽類似，苯甲酸也是食品中常見的防腐劑，Liu等[59]開發的紙基微流控芯片通過檢測區域顏色變化將檢測結果傳送至智能手機，此裝置與HPLC法結果接近，已成功應用于市場上醬油、蘿卜干和辣椒醬等21種食品的苯甲酸檢測。

1.5 重金屬檢測

重金屬中毒是影響食品安全的另一主要原因[60]，重金屬如鉛(Pb)、鎘(Cd)、鋅(Zn)、汞(Hg)、砷(As)、銀(Ag)、鉻(Cr)、銅(Cu)、鐵(Fe)和鉑金(PT)等一般很難降解，不僅對環境造成持續污染，還能通過空氣、食物和水分進入人體引發癌癥等多種疾病[60-62]。因此，開發快速、可靠的重金屬檢測方法具有重要意義。傳統的重金屬檢測法主要是火焰原子吸收光譜法、電感耦合等離子體光發射光譜法和電感耦合等離子體質譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICPMS)等，這些方法都是基于固相萃取柱對金屬離子預處理，耗時費力，且分析儀器昂貴，對分析低于檢測限的痕量金屬離子仍然具有挑戰性，使它們在現場篩選和監測中無法應用，微流控技術的出現實現了對重金屬離子的現場測量。

玄翠娟[26]在一個裝置中同時使用2個進樣帶和檢測區制作的新型雙通道紙基微流控芯片，實現了雙通道微流控測定汞離子。微流控芯片與光致發光氧化石墨烯傳感器(graphene oxide quantum dot，GOQD)結合實現了對痕量鉛離子的現場檢測，樣品在芯片上預處理的同時通過陽離子交換樹脂對痕量金屬離子預濃縮，利用熒光GOQD傳感器對水樣中鉛離子檢測，檢測限為0.64 nmol/L，檢測范圍為1～1000 nmol/L[63]。利用3D打印制作的具有所需形狀的電化學微流控芯片，對重金屬離子具有優異的電化學檢測特性，通過對樣品中鎘和鉛的測定，結果表明，鎘離子的線性范圍為0.5～8 g/L，檢測限為0.5 g/L，鉛離子的線性范圍為10～100 g/L，檢測限為0.2 g/L，檢測結果比世界衛生組織提出的指南值低約6倍和50倍，該裝置具有良好的穩定性和再現性，特別適用于家庭和資源匱乏的地區[64]。

上述微流控芯片檢測多用于單一成分的檢測（結構類似物或化學相似物），而熒光標記的單鏈DNA功能化的石墨烯氧化物傳感器是一種低成本、制作簡單的紙基微流控芯片，可以同時測定食品中多種化學物質，如重金屬（汞和銀）以及氨基糖苷類抗生素（新霉素），汞離子、銀離子和新霉素的檢測限分別為121、47、153 nmol/L，加標回收率分別為87%～116%、91%～126%、95%～101%[65]。基于磁性編碼適體探針與微流體芯片相結合的方法，可同時對重金屬離子（鉛離子）、抗生素（卡那霉素）和雌激素（17β-雌二醇）痕量檢測，結果表明卡那霉素、17β-雌二醇和鉛離子的檢測限分別為1.76×10-4nmol/L、1.18×10-4nmol/L和1.29×10-4nmol/L，該裝置不僅可以同時測定食品中的有機物和無機物，還可以重復使用，可用于檢測至少4000個樣本。該裝置已成功應用于牛奶、魚和豬肉中卡那霉素、17β-雌二醇和鉛離子的檢測。通過與國家標準方法（電化學、熒光法等）對比，該方法具有明顯的選擇性和準確度[66]。基于編碼發夾探針修飾的攪拌棒結合微流控芯片同時測定汞離子和銀離子，可以重復檢測至少3000次，汞離子檢測限為0.054 nmol/L，線性范圍為0.18～50 nmol/L，銀離子檢測限為0.038nmol/L，線性范圍為0.12～100nmol/L，汞離子回收率為90%～115%，銀離子回收率為90%～110%，結果與ICP-MS法結果一致。該裝置已成功應用于自來水、牛奶、魚類中汞離子和銀離子的檢測。通過與國家標準方法（電化學、熒光法等）對比，該方法具有明顯的選擇性和準確度[67]。基于量子點的熒光傳感微流控芯片離子印跡法檢測銅離子，線性范圍為0.032～3.20 mg/L，檢出限為0.012 mg/L。已應用于湖水及海水樣品中銅離子含量的檢測，與ICP-MS檢測結果相比，這種基于熒光傳感的印跡紙芯片具有良好的分析性能[68]。一次性紙基傳感器能在弱酸性(pH 2.0)條件下，從含Fe3+、AI3+，Zn2+、Cd2+、Pb2+、Ca2+、Mg2+、Ni2+等金屬離子的自然水和廢水中選擇性的識別Cu2+，Cu2+的檢測限和定量限分別為0.06 mg/L和0.21 mg/L，線性范圍為0.1～30 mg/L，與原子吸收光譜法的檢出限相當。該方法已成功地應用于測定自來水和尾礦水中Cu2+的檢測[69]。

2 展望與結語

綜上所述，微流控芯片已成功應用于飲品、蔬菜、水果、肉類中食品成分、農藥和獸藥殘留、重金屬及食品添加劑的高效便攜、準確快速檢測。微流控芯片作為一種新技術，集物理學、電化學、材料學、分子生物學、機械科學等為一體，可以實現食品污染物的靈敏、快速檢測。但目前微流控芯片仍然處于早期發展階段，盡管微流控芯片在食品安全檢測中展現出巨大的發展潛力，并且微流控芯片與其他檢測方法相結合，可以滿足多種食品污染在傳統檢測方法中的限制，但由于其他設備的龐大性，增加了便攜檢測的難度。值得注意的是，目前的微流控芯片技術多用于食品中單一污染物的檢測，對于食品中多種污染物仍然無法滿足同時檢測的市場需求。因此，開發新型加工材料并推動微流控芯片產業化和市場化是未來發展的新趨勢。