弓形蟲毒力因子ROP18研究進展

劉俊 孫濤

1邵陽學院附屬第一醫院檢驗科，湖南 422000；2湖南省邵陽市中心醫院血液腫瘤實驗室 422000

弓形蟲有性生殖只存在于貓科動物的宿主體內，但由于家鼠在世界范圍內分布廣泛，并與家貓共生，它們也可能是弓形蟲的重要中間宿主［1］，一些弓形蟲菌株對實驗室小鼠表現出高致病性。為了保護納蟲空泡膜（parasitophorous vacuole membrane，PVM）的完整性，弓形蟲進化出了幾種多態效應蛋白，不同的多態性蛋白質對免疫耐受系統的抑制起重要作用［2］。弓形蟲Ⅰ型強毒株的棒狀體蛋白18（ROP18）核苷酸結合位點高度保守區域具有蘇氨酸激酶催化活性。某些弓形蟲Ⅱ型無毒株也表達了ROP18的毒性等位基因型［3］，但其PVM的免疫相關GTP酶（IRG）未能積累到感染小鼠細胞的程度。宿主和病原體之間相互施加選擇壓力，導致種群遺傳結構的動態變化和共同進化的變化，這些變化有助于增強病原體的毒力和宿主抗性，有研究預測，許多蛋白質序列的多態性變化將支持產生這種相互作用。對涉及宿主抗性和病原體毒力的這些多態性分子進行了解并對其功能機制進行分析，對疾病控制具有潛在的重要意義。本文綜述分析了弓形蟲分泌的重要的毒力因子ROP18的相關特性。

1 ROP18與ROP5的相互作用

雖然沒有發現弓形蟲ROP5的特異性功能，但有研究報道了ROP5與ROP18的相互作用可以提高ROP18的活性來增強弓形蟲的毒力［4-5］。ROP5基因座由一群密集重復的基因組成，編碼3種不同的ROP5亞型，ROP5a、ROP5b和ROP5c，每一種弓形蟲病原體株中都包含多種亞型［6］。這些ROP5基因的單個序列幾乎是相同的，但在弓形蟲Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型株間表達差異很大。ROP5和ROP18通過磷酸化核苷酸結合位點——高度保守的蘇氨酸殘基來抑制IRG抗性系統。在這些文獻研究中，發現致密顆粒蛋白7（GRA7）與ROP5直接相關，并且對于干擾素誘導產生的GTP酶（IFN-γ-inducible GTPase6，IRGa6）的有效磷酸化必不可少［7-9］。因此，GRA7的丟失與否可能與體內寄生蟲的毒力直接相關。有研究表明GRA7是一種非免疫特異性弓形蟲效應物，并提出了一種通過調節ROP18激酶活性來解釋GRA7分子功能的模型，此模型還發現IRGa6也是IRG蛋白中ROP18唯一的特異性靶標［10］。ROP18對體內IRGa6特異性功能表明，可能還存在某些其他未知的弓形蟲毒力效應物可能對其他IRG蛋白具有嚴格的特異性。

2 ROP18通過磷酸化GTPases蛋白作用免疫逃逸

在寄生蟲入侵的過程中，弓形蟲通過分泌一些特殊的物質將毒力決定因子傳遞到宿主細胞中。ROP18的決定簇是一種多態性絲氨酸/蘇氨酸激酶，它能磷酸化宿主目標細胞，調節蟲體毒性［11］。隨著分泌物進入宿主細胞，ROP18轉運到PVM上，并與宿主-病原體界面的細胞膜相連。但是，ROP18-PVM關聯的功能機制尚不清楚。在某些研究文獻中，發現ROP18突變體在激酶結構域上游富含精氨酸的結構域改變后，不再與PVM結合［12］。在感染期間，宿主細胞上調免疫相關的GTP酶蛋白，定位并破壞寄生蟲周圍的PVM。ROP18通過磷酸化關鍵的GTP酶蛋白結構域的免疫反應基因來逃逸宿主的先天免疫通路［13-14］。ROP18的靶向突變體不能磷酸化IRGa6并且無法將IRGs從PVM轉移，盡管保留了內在的激酶活性，但這些突變體在小鼠急性弓形蟲病模型中是無毒的。因此，ROP18與PVM的關聯可能是由其富含精氨酸的N端結構域介導的，且對其作為毒力決定因子的功能至關重要。

3 ROP18對宿主細胞轉錄影響

為了進一步加深對ROP18分子功能的理解，有學者研究了人胚腎細胞（HEK-293T）中弓形蟲RH株ROP18的轉錄反應。通過RNA測序，研究比較了HEK-293T細胞的ROP18轉錄組對HEK-293T細胞的作用［15］。分析發現，ROP18改變了HEK-293T細胞中750個基因（467個上調基因和283個下調基因）的表達。基因本體論和病理富集分析表明，差異表達基因在細胞外間質和免疫相關通路中顯著富集［16］。富集分析顯示DEGs參與多種疾病相關的通路，如神經系統疾病和眼病［17］。ROP18顯著增加了“保留內含子”的選擇性剪接模式，改變了144轉錄因子（TFs）的表達。這些發現為研究ROP18如何通過改變基因、TFs和通路來影響宿主細胞的生物學過程提供了新的視角。ROP18在基因轉錄水平上對細胞周期過程沒有明顯的影響［18］。然而，另一個效應蛋白ROP16在宿主細胞周期中發揮了重要作用［19-20］。這2種毒力相關蛋白（ROP16和ROP18）對宿主細胞周期影響的差異可能是由于其宿主靶基因的差異。在之前的研究中，發現Rh菌株的ROP18與492個宿主蛋白相互作用［21］。在研究中，發現只有少數幾個相互作用的蛋白表達水平顯著改變。這種差異可能歸因于轉染的宿主細胞行為的變化。ROP17和ROP18都是ROP2家族的分泌蛋白，在宿主細胞中有相似的位置。通過比較宿主中ROP17和ROP18的轉錄反應，發現與ROP17和ROP18相關分別有110個和276個表達降低或增加的基因［22］。這種在宿主細胞內的位置以及對宿主細胞轉錄組的影響上的相似性與ROP17和ROP18共享一些宿主細胞靶點的事實相一致。ROP5與ROP18和ROP17形成復合物，介導弓形蟲在小鼠體內的存活。鑒于ROP18的功能相互作用和重疊，研究ROP5、ROP16、ROP17、ROP18同時表達對宿主細胞轉錄重編程的影響，可以提高對剛地弓形蟲毒力機制的認識。有研究分析了HEK-239T細胞對ROP18表達的轉錄組反應，研究發現，ROP18對宿主基因的表達有顯著影響，其中有750個基因表達上調，467個基因表達上調，283個基因表達下調［23］。主要涉及顯著改變的基因的功能在細胞外基質組織、免疫反應和疾病過程中。進一步研究ROP18的催化活性突變體對細胞轉錄的影響，并使用不同的細胞系，可進一步了解和明確弓形蟲與宿主細胞過程相互作用的機制。

4 結 論

弓形蟲可以說是最成功的專性細胞內寄生蟲之一。一旦受污染的食物或水中含有感染性卵囊或速殖子，就會感染各種溫血脊椎動物。據報道，全世界大約有1/3的人口感染這種寄生蟲，不同國家的感染率不同。在被感染的人中，大多數人由于強大的免疫功能控制，表現出輕微或無明顯癥狀。然而，對于孕婦和免疫系統受損的個體，如艾滋病、癌癥化療和移植，弓形蟲感染可能導致嚴重的健康問題。在寄生蟲感染的疾病中，先天性弓形蟲病被報道為最嚴重的疾病之一，每10 000個活產兒中有1～15個發病。通常，先天性弓形蟲病有不同的癥狀，包括腦積水或小頭畸形，腦內鈣化和脈絡膜視網膜炎等。

已知分泌的ROP18在寄生蟲蟲體主動進入宿主細胞并最終操縱宿主細胞以滿足其需要方面發揮重要作用。在這些分泌的蛋白中，ROP18被認為是能夠影響宿主細胞功能的關鍵毒力因子。它在弓形蟲Ⅰ型和Ⅱ型菌株中高度表達，作用于PVM。據報道ROP18能磷酸化其他ROP蛋白（即ROP2、ROP4和ROP8），并與其他宿主細胞蛋白相互作用。例如，它通過激活轉錄因子6和p65來抑制宿主的天然免疫和適應性免疫反應，從而達到免疫逃逸的目的。盡管人們對ROP18介導的通過免疫逃逸而產生毒力的機制進行了深入的研究，但這種激酶在宿主細胞中發揮致病作用的確切分子機制仍不清楚，我們下一步工作可針對ROP18對宿主細胞凋亡的影響繼續展開更加深入的研究。