冠心病不同證候的蛋白質組學研究進展*

葉嘉豪，胡志希，楊 夢，鐘森杰，邱 宏，熊霞軍

（湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

冠心病是由于冠狀動脈粥樣硬化病變所導致血管狹窄或阻塞而引發心肌組織缺血、壞死而引起的心臟病[1]。本病在中醫學中屬“胸痹、真心痛”范疇，以膻中或左胸部發作性憋悶、疼痛為主要臨床表現。根據《中國心血管病報告2018》統計[2]，我國目前估計心血管病現患病總人數為2.9億，其中冠心病患者為1100萬。冠心病中醫證候分布調查顯示[3]，冠心病主要中醫證候為心血瘀阻（23.75%）、痰濁內阻（20.00%）、氣虛血瘀（13.75%）、氣陰兩虛（11.25%）、痰瘀互阻（8.75%），說明瘀、痰、氣虛、陰虛在冠心病的形成中占主導地位，是導致冠心病發作的關鍵因素。目前蛋白質組學已廣泛應用于冠心病研究中，冠心病的病理過程中伴隨著蛋白質組學的改變，應用蛋白質組學有助于冠心病的診斷及辨證分型。筆者就近年來的研究進展作一綜述，闡明其診斷價值，為后續研究提供借鑒。

1 蛋白質組學在冠心病疾病診斷中的應用

蛋白質組學通過收集冠心病患者的血漿、尿液等樣本，進行蛋白質組學檢測，尋找與正常個體的差異蛋白，并闡明與之相關的生物學信息。

1.1 血漿蛋白質組學冠心病血漿蛋白質組學目前檢測方法有同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）、液相色譜—串聯質譜（LC-MS）技術等，iTRAQ技術具有分離能力強、分析范圍廣、結果可靠、分析時間快、自由化程度高等優點，而LC-MS技術具有靈敏度及可重復性高、價格經濟等優點[4-7]。區文超等[8]運用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOFMS）技術檢測冠心病患者和健康人的血漿樣本，結果發現絲束蛋白-2、膜聯蛋白、凝集素、PGAM1、FGG、IGKC等存在差異。郭志鵬[9]通過iTRAQ技術測量冠心病患者與正常人的血漿樣本，結果顯示，上調的差異蛋白有35個，涉及凝血因子XIII B鏈、血小板因子4及分泌型卷曲相關蛋白等多個蛋白；下調的差異蛋白有41個，涉及維生素D結合蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶及備解素等蛋白。KRISTENSEN L P等[10]運用iTRAQ技術研究冠心病患者的血漿樣本，認為黏著斑蛋白可作為冠心病的一種新標記物。

目前在冠心病血漿蛋白質組學上，與健康人群比較，冠心病患者存在凝血、補體激活、脂類代謝、參與炎癥反應等多個層面的生物學改變，如絲束蛋白-2可促進受損內膜聚集，繼而引起冠心病的發生；膜聯蛋白涉及調控細胞增殖凋亡、細胞黏附等作用，冠脈狹窄程度與其高表達相關，說明冠心病在發生發展時，存在凝血、免疫、脂質代謝等多系統紊亂。目前通過運用多種檢測技術測量患者的血漿成分，能夠較為全面地分析其存在差異，也為后續科研提供數據支持。

1.2 尿液蛋白質組學尿液蛋白質組學相對于血漿蛋白質組學，具有采集簡單、無創、容易連續性獲得的優點，并且某些蛋白質由于入血后快速經腎臟代謝入尿，所以尿液蛋白質組學還能檢測出某些特定的蛋白質[11]。GISTER A等[12]通過ELISA檢測患者心肌梗死后1 h的尿液，發現hh-FABP能輔助診斷超早期急性心肌梗死。LEE M Y等[13]運用LC-MS技術檢測不穩定型心絞痛患者與對照組的尿液樣本。結果顯示：與對照組比較，冠心病患者中表達上調蛋白為CD14，并認為CD14能大規模診斷、篩查早期冠心病心絞痛患者。國外有學者通過尿蛋白質組學技術發現尿纖維蛋白、尿微量白蛋白、尿肝型脂肪酸結合蛋白等可作為臨床診斷冠心病的依據[14-16]。

尿液蛋白質組學研究發現冠心病患者與健康人在免疫、凝血等系統存在差異，如冠心病發病時，機體纖維蛋白原水平快速升高，導致血液處于高凝狀態，繼而導致腎功能受損，腎小球濾過功能下降，導致出現尿微量蛋白及尿肝型脂肪酸結合蛋白等指標的異常，因此可以通過尿液蛋白質組學技術輔助冠心病的診斷。

2 冠心病中醫證候蛋白質組學研究

蛋白質組學可為冠心病的診斷治療提供輔助依據，同時也為中醫學研究冠心病“證”之間存在的差異提供了技術支持。對不同證候的樣本進行蛋白質組學研究，篩選出差異蛋白，可研究該蛋白能否作為該證候診斷的金標準[17]。

2.1 冠心病“實證”蛋白質組學研究冠心病是本虛標實、虛實夾雜的復合性疾病，標實以血瘀、痰飲、痰瘀為主，其中血瘀是冠心病致病的關鍵[18]，也是冠心病最常見、最多發的中醫證型。痰證和痰瘀互結證在發病早期所占比例較少[19]，但隨著病情的演變，中后期以痰證和痰瘀互結證為主。

2.1.1 血瘀證 冠心病血瘀證為目前研究熱點之一，研究發現與正常人比較，血瘀證存在凝血功能異常、血脂異常及炎癥反應異常，具體表現為全血黏度增高，血小板活化，血流動力降低，血液處于高凝狀態。以上可作為冠心病血瘀證辨證的依據。李雪峰等[20]運用MALDI-TOF-MS技術檢測冠心病心血瘀證患者與正?；颊叩难獫{樣本，發現CD41和Actinγ等7種差異蛋白，并認為CD41和Actinγ有望成為冠心病心血瘀證的標記蛋白。周倩倩等[21]通過MALDI-TOF-MS技術檢測冠心病心血瘀證患者和正常人的血漿樣本，發現差異蛋白為視黃醇結合蛋白、結合珠蛋白、血清白蛋白、載脂蛋白。趙慧輝等[22]應用HDMS與UPLC聯用檢測冠心病心血瘀證患者和健康人血漿樣本，發現上調蛋白13種，根據功能分為急性時相反應蛋白、補體蛋白、細胞骨架蛋白、凝血相關蛋白；下調蛋白12種，根據功能分為載脂蛋白、運輸蛋白、抗凝血相關蛋白、免疫球蛋白、細胞骨架調控蛋白。肖隋熙[23]應用iTRAQ技術檢測78例冠心病心血瘀證患者和34例冠心病非心血瘀證患者的血漿差異蛋白質，發現11個上調的差異蛋白和16個下調的差異蛋白。其差異蛋白功能主要涉及細胞遷移、細胞損傷表達、細胞變性等。

以上研究分別運用MALDI-TOF-MS技術、iTRAQ技術、HDMS與UPLC聯用技術，檢測冠心病血瘀證與正常模型組的血液樣本，并發現其差異涉及炎癥反應、凝血功能、免疫反應、脂質代謝等，具體差異蛋白為CD41、視黃醇結合蛋白、結合珠蛋白、血清白蛋白、載脂蛋白等。說明在疾病初期血瘀證階段，其病理改變以凝血、炎癥、免疫、脂質代謝等通路紊亂為主。瘀血阻滯，導致血液黏稠度增加、微循環障礙，血流不暢，瘀阻心脈，最終導致了冠心病的發生。

2.1.2 痰證 冠心病痰證與血瘀證的共同特點為凝血、脂質代謝紊亂，但兩者在蛋白質組學表達方面均有側重，痰證以脂質代謝異常所導致的“高脂”為主要特點，血瘀證以凝血系統紊亂為主。朱明丹等[24]采用ESI－MS技術對冠心病心氣虛證、心腎陰虛證、痰濁內阻證、心血瘀證各9例患者的血清樣本進行蛋白質組學研究，發現與血瘀證比較，痰證上調蛋白為血清淀粉樣P物質、載脂蛋白E、凝溶膠蛋白亞型1、巨噬細胞刺激蛋白1、載脂蛋白H，下調蛋白為α-2-巨球蛋白、補體C4、補體成分C3、抗凝血酶Ⅲ。宋劍南等[25]利用雙向凝膠電泳-質譜技術檢測痰證、血瘀證、痰瘀證患者和正常人的血漿樣本，發現痰證與血瘀證的差異蛋白為結合珠蛋白前體、腎上腺髓質素結合蛋白前體、白蛋白、補體C4。

冠心病痰證主要體現在脂質代謝（載脂蛋白E、載脂蛋白H等）、免疫系統（巨噬細胞刺激蛋白1）、凋亡系統（凝溶膠蛋白亞型1）異常，而血瘀證主要體現在補體（補體C4、補體成分C3）、凝血系統（抗凝血酶Ⅲ）等異常。

2.1.3 痰瘀互結證 痰瘀互結證與痰證、血瘀證比較，其特點表現為凝血、脂質代謝進一步紊亂，血液處于高凝、高脂狀態，血流動力進一步降低。“高脂、高凝”可能為冠心病痰瘀互結證的特點。苗蘭等[26]采用雙向凝膠電泳、基質輔助激光解析-飛行時間質譜技術檢測小型豬冠心病痰瘀證的心肌組織，結果顯示：與正常組比較，小型豬冠心病痰瘀證載脂蛋白E升高，補體C4降低。宋劍南等[25]發現與痰證比較，痰瘀互結證的上調蛋白為纖維蛋白原β鏈、白蛋白、補體C4、血紅蛋白結合蛋白前體、結合珠蛋白前體，下調蛋白為載脂蛋白AI前體、α-1抗胰蛋白酶片段、簇連蛋白前體等。說明痰瘀互結證、痰證差異蛋白體現在凝血系統（纖維蛋白原β鏈）、補體系統（補體C4）、脂質代謝（載脂蛋白AI前體、載脂蛋白E）、血漿轉運蛋白（白蛋白）、炎癥反應相關蛋白（α-1抗胰蛋白酶片段、血紅蛋白結合蛋白前體）等方面。

從初期的血瘀證到中期的痰證及痰瘀互結證，冠心病主要以脂質代謝指標升高、凝血等指標下降為主要表現。該結論可能與疾病的傳變存在一定關聯，血瘀證引起氣血的停滯，氣滯無力推動津液運行，或血瘀迫津外出，導致痰濁的內停；而痰濁內停也會引起氣血津液的停滯，最終引起血瘀證的發生或加重，兩者導致疾病螺旋發展，最終形成“痰瘀互結證”?！疤怠焙汀梆觥痹诓±砩匣ビ袀戎?，如痰證在脂質代謝異常方面較明顯，可能由于痰濁內停，損傷脾陽，導致運化功能失常，從而導致人體脂質代謝功能的紊亂；而凝血系統異常主要以血瘀證、痰瘀互結證較明顯，可能因為血瘀導致氣血流動不暢，血流動力下降引起血液黏稠，進而導致凝血、補體指標升高。

2.2 冠心病“虛證”蛋白質組學研究冠心病病機為本虛標實、虛實夾雜，本虛以心氣虛證、心腎陰虛證為主，其發病初期比例低于血瘀證，但是隨著疾病的發展，后期主要以心腎陰虛證、氣虛證等虛證為主。

2.2.1 心腎陰虛證 王剛等[27]采用熒光差異蛋白電泳、質譜技術檢測冠心病心血瘀證與心腎陰虛證患者的血漿差異蛋白，結果顯示：與心腎陰虛證比較，心血瘀證患者的α2巨球蛋白、載脂蛋白A1、載脂蛋白E、補體C3、補體C1q亞成分亞基C、血紅素結合蛋白和激肽酶蛋白含量較高，而聚集素、血清淀粉樣P物質含量較低。朱明丹等[24]發現，與心腎陰虛證比較，冠心病血瘀證的上調蛋白為血紅素結合蛋白、載脂蛋白E、α2巨球蛋白、載脂蛋白A-I、補體C1、載脂蛋白4前體、補體C3、激肽酶-1蛋白，下調蛋白為聚集素、血清淀粉樣P物質。

上述2項研究結果大致相同，說明冠心病心腎陰虛與血瘀證的差異蛋白為補體C3、補體C1、載脂蛋白A1、載脂蛋白4前體、載脂蛋白E、α2巨球蛋白、激肽酶-1蛋白、血紅素結合蛋白、聚集素、血清淀粉樣P物質，其差異蛋白主要涉及補體系統（補體C3、補體C1）、脂質代謝（載脂蛋白A1、載脂蛋白4前體、載脂蛋白E）、激肽釋放酶-激肽系統（激肽酶-1蛋白）、阿爾茨海默信號通路（聚集素、血清淀粉樣P物質），可用于作為辨別心血瘀證與心腎陰虛證的指標，同時其含量的降低可能為心腎陰虛證形成的內在基礎。

2.2.2 心氣虛證 袁宏偉等[28]采用雙向電泳-質譜技術對冠心病心氣虛證和心腎陰虛證患者的血漿進行分析，結果顯示，與心腎陰虛證比較，心氣虛證患者的上調蛋白為血紅素結合蛋白、補體C7、補體C3、補體C4-A、凝血酶原、血漿血管舒緩素，下調蛋白為α2巨球蛋白、富含組氨酸糖蛋白、載脂蛋白4前體、甘露糖結合蛋白C、載脂蛋白D、載脂蛋白A-I、活化T細胞核因子5亞型b、纖溶酶原、補體因子H亞型1。朱明丹等[24]發現，與心血瘀證比較，氣虛證患者的上調蛋白為補體C3、α2巨球蛋白、補體C4-A、血紅素結合蛋白、補體C7、結合珠蛋白亞型1、血漿血管舒緩素、抗凝血酶Ⅲ，下調蛋白為CPN1、羧肽酶N催化鏈、聚集素。

以上2項研究說明氣虛證補體C3、補體C4-A、補體C7、血紅素結合蛋白、血漿血管舒緩素的含量低于血瘀證、心腎陰虛證；差異指標主要涉及補體（補體C3、補體C4-A、補體C7）、激肽系統（血漿血管舒緩素）及炎癥反應相關蛋白（血紅素結合蛋白）；血瘀證、氣虛證以上指標存在一定差異，可能為初期以血瘀證為主，血瘀導致氣血津液的停滯，故會導致補體、激肽、免疫系統異常，以及炎癥相關蛋白、脂質代謝紊亂等蛋白質異常；而血瘀日久，耗傷正氣，最終由實轉虛，屬于由實轉虛的過程，故其病理特點并非器質性病變，而是以氣虛無力固攝血液的生理性改變，故凝血因子含量會有所下降；同時氣虛不能固表，衛氣虧虛導致了自身免疫功能下降[29]，推斷出冠心病后期氣虛證的主要特征為炎癥反應、免疫系統、脂質代謝等方面的蛋白質含量降低。

2.3 總結目前冠心病中醫證候蛋白質組學在實驗中已經初步揭示出正常人、冠心病患者及其不同證型之間的差異蛋白，一定程度上說明蛋白組學與中醫證候演變的相關性，可為以后研究疾病演變規律及證的本質研究提供數據基礎。蛋白質組學雖能檢測出差異蛋白，但是目前技術仍存在一定局限性[30-32]。

3 該領域所存在的問題及可能的解決方法

3.1 規范證候診斷目前蛋白質組學實驗設計方案復雜多樣，如證候存在規范標準問題，且證有兼夾，證與證之間存在輕重、先后、主次、標本之別。因此，蛋白質組學檢測不能避免由于樣本、動物模型、造模方式、檢測技術方法所導致的蛋白差異[33-36]，即使篩選出不同證型的差異蛋白，但不能確定其與證候間的關聯程度。其次目前已經開展了大量蛋白質組學實驗，但對于每個證的蛋白組“金標準”還沒有確定等[37]。針對以上研究問題，筆者認為，要進一步完善蛋白質組學的相關技術，制訂相應的國家、行業技術標準，嚴格設計調查方案和標準操作規程，控制所有可能影響結果的因素，實驗以人作為對象應盡量控制年齡、環境、基礎病、人種、居住地、社會壓力、生活方式等所產生的差異；對于實驗動物應嚴格控制造模方式、檢測技術、種類、數據處理的方法等；開展大規模、大樣本的臨床研究，增加樣本量，從中獲得大量高質量、可信度高的數據；重復實驗，驗證結果，進一步完善和制定符合臨床實際的證候診斷標準，最終得到其證候診斷的金標準。

3.2 優化研究設計冠心病蛋白質組學研究多集中于單一證型上，而中醫證型往往存在證候錯雜，單一證型不能滿足中醫證候的復雜性[38]；目前的研究缺乏對中醫異病同治的深入探討，缺乏了對于疾病綜合了解。筆者認為，可以根據西醫冠心病辨病分期及中醫辨證分型，進行樣本再細化，滿足中醫證型上復雜性，更深層次挖掘中醫證候的本質。

3.3 創新技術手段目前中醫對蛋白質組學還存在這一些問題，如對海量信息的分析處理能力、對小分子蛋白處理能力不足等[39-41]。筆者認為，目前應開展多組學技術相互聯用，整合分子生物學、生物信息學，并建立完善冠心病證型相關的數據庫，如“冠心病證候—蛋白質表達譜”，結合統計學進行分析，最后通過網絡藥理學、Meta分析進行綜合評價，引入權重量化概念，通過不同的蛋白加權，篩選出區分中醫證型標記物及明確各差異蛋白與證候的關聯程度，為冠心病診治提供科學依據，降低臨床誤診率及患者發病率，提高診療效率及患者生活水平，推動中醫藥精準治療進程，為中醫藥邁向世界提供實驗數據支持。